常見細胞污染類型如何辨別及預(yù)防解決方法
常見細胞污染類型如何辨別及預(yù)防解決方法:細胞培養(yǎng)中常見的生物污染類型有7種,分別是細菌污染,支原體污染,原蟲污染,黑膠蟲污染,真菌污染,病毒污染以及非細胞污染,真菌污染來源,一般是來自實驗服,并且具有氣候性,多雨······
發(fā)布時間:2022-11-16 14:57:06 細胞資源庫平臺 訪問量:694
不知道小伙伴在細胞培養(yǎng)過程中,有沒有遇到細胞消化過后,仍有些細胞分散不開,吹又不敢吹,棄又棄不凈,結(jié)果聚團細胞像滾雪球一樣越聚越大、越聚越多情況,細胞聚團原因是什么,是污染還是操作失誤,遇到細胞抱團如何處理呢?
我們知道當在生長培養(yǎng)基中進行單懸浮細胞培養(yǎng)時,樣本中出現(xiàn)細胞丟失的情況并不少見。當細胞破裂時,它們會釋放DNA和碎片,導(dǎo)致細胞聚集成大團塊,使其難以擴張。細胞聚團既可導(dǎo)致細胞凋亡,也可引起細胞死亡。隨著更多的細胞死亡并釋放碎片,問題將繼續(xù)惡化,所以盡可能快地處理或避免細胞聚團將有利于實驗的后續(xù)結(jié)果。
首先要明確一點,常規(guī)的“抱團”是指貼壁細胞被消化后懸浮狀態(tài)下的聚集情況。細胞在貼壁生長時,聚集在一起是正?,F(xiàn)象。當周圍細胞寥寥無幾,而這一團已經(jīng)疊層生長,這就是在懸浮狀態(tài)就已經(jīng)聚團的細胞再貼壁導(dǎo)致的。相同條件下,培養(yǎng)的癌細胞對密度依賴性的生長抑制敏感性降低,所以即使在形成單層后,也不會停止生長,而是相互堆積形成多層生長的聚集體。
防止細胞聚團的最佳方法之一是了解是什么導(dǎo)致了細胞聚集,并采取預(yù)防措施避免這些事件的發(fā)生。培養(yǎng)物中細胞可能聚集的一些原因包括:
某些用于組織分解的酶,如胰蛋白酶,如果過量使用會導(dǎo)致細胞結(jié)塊。很多人覺得細胞多多益善,經(jīng)常將貼壁細胞養(yǎng)到疊層、或密集程度特別高時才進行傳代,如果一直這樣,不僅會縮短傳代時間,導(dǎo)致操作密集;同時細胞的老化會更加嚴重。另外,細胞死亡時釋放DNA,會“抓住”其他細胞,形成黏性的細胞團,若不及時處理,整體細胞狀態(tài)會惡性循環(huán)。
物理壓力和反復(fù)的溫度變化會導(dǎo)致細胞死亡,從而導(dǎo)致細胞的“粘性”的DNA分子將相鄰的細胞連接在一起
在制備單細胞懸浮液時,使用酶、機械或化學(xué)分解策略可使細胞破裂,從而導(dǎo)致碎片的聚團。
當細胞在其培養(yǎng)基中密度過大的時候,細胞將開始溶解并釋放碎片,碎片中的粘性因子會將細胞聚集到一起
某些細菌和真菌病原體導(dǎo)致細胞溶解;結(jié)塊通常是細胞培養(yǎng)物被污染的跡象。部分細胞被污染后會出現(xiàn)細胞聚團,這和操作有很大關(guān)系,比如:傳代鋪板時,是否進行了活細胞計數(shù)并及時調(diào)整濃度;終止消化時間點是否準確;混勻是否過于輕柔或粗暴;胰酶是否濃度過高;離心收集時,加速度是否過大等,都會直接影響子代細胞狀態(tài)。
6.雖然其中一些是由于實驗錯誤而發(fā)生的,但實際也有部分的細胞具有天生的聚團現(xiàn)象,比如大部分的半懸浮細胞,BV-2 ,NCI-H716等等,半懸浮細胞一般在在整體匯合度70%左右就要進行傳代操作了,這樣可以降低細胞聚成大團塊的風(fēng)險。
單細胞懸浮培養(yǎng)基的目標是為靶細胞提供盡可能多的生長資源。這包括充足的生長營養(yǎng)和充足的繁殖空間。當細胞聚集在一起時,它們會相互限制,降低細胞對營養(yǎng)吞吐量,最終影響生長結(jié)果。
細胞聚團也會導(dǎo)致靶細胞的回收率降低,并且會干擾標記,這也是懸浮細胞標記的成功率不高的原因,某些細胞分析方法,如流式細胞術(shù),需要對細胞進行適當?shù)姆蛛x。在流式細胞術(shù)中,大量細胞以快速的液流通過機器。這臺被稱為細胞儀的機器檢測不同細胞之間物理特性的差異,并使用熒光燈對它們進行相應(yīng)的標記。如果細胞通過試管時聚集在一起,細胞儀將很難準確測量它們的特性。這會導(dǎo)致它們被不正確地分類,并對實驗結(jié)果產(chǎn)生負面影響。
若細胞輪廓清晰,胞體通透,呈串狀均勻聚集,證明其狀態(tài)較好,正在分裂。但是大多數(shù)情況下,聚團細胞都是輪廓模糊,細胞透光性差,甚至出現(xiàn)合胞體,同時伴有細胞碎片,這證明細胞已經(jīng)衰老或者產(chǎn)生病變,狀態(tài)不佳。
首先確認當前細胞生長密度及狀態(tài),80%左右的生長密度即可進行傳代,此時細胞狀態(tài)較好,且用于傳代的數(shù)量也足夠。
傳代操作前,使用緩沖液對細胞進行適當且全面地潤洗,清除死亡的細胞團和部分堆疊雜質(zhì)(在選擇適當胰酶濃度時,對于不同代數(shù)的不同細胞系需進行一定的調(diào)整,如:部分貼壁牢固的細胞應(yīng)將胰酶分裝后,進行預(yù)熱處理;細胞密度過高時,應(yīng)該向胰酶中加入少量緩沖液,緩慢均勻地消化細胞等。對于貼壁格外牢固的細胞,可以嘗試多次分批進行消化,最大限度保證細胞狀態(tài))。
在消化過程中,需均勻慢速晃動培養(yǎng)器皿,以免局部胰酶濃度過高而影響傳代。切勿用力搖動,導(dǎo)致邊緣松動的大片細胞直接脫落,從而增加細胞成團幾率。
培養(yǎng)器皿的選擇也需注意,部分實驗室會使用玻璃培養(yǎng)瓶,因細胞貼壁在玻璃底更容易分離。同時玻璃材質(zhì)的親水性和塑料有區(qū)別,而且玻璃細胞培養(yǎng)瓶都是實驗室內(nèi)部處理,可能會有清潔殘留,在一定程度上抑制細胞的貼壁生長,并且更容易消化,細胞之間的連接比貼壁還要緊密,聚團幾率很大。
另外,避免傳代過程中匯合度較大,本身1:3甚至1:4都可以正常培養(yǎng)的細胞被1:2傳代,會導(dǎo)致母代細胞濃度過高,在分化過程中出現(xiàn)堆疊現(xiàn)象,所以在每次細胞傳代前要對細胞進行計數(shù)。
適當?shù)奶幚砗驮O(shè)備使用,也可以減少結(jié)塊。如果使用離心機分離或混合樣品,將其設(shè)置為正確的速度可以減少聚團,通常情況下,較快的速度可以離心散細胞,但在高速下也必須考慮細胞的脆弱性,所以適當?shù)难娱L離心的時間也不失為一種穩(wěn)靠的離心散懸浮聚團細胞的方法。
還有一些方法可以分離細胞,這些細胞聚集在一起,不會造成過度的傷害。某些叫做螯合劑的化學(xué)物質(zhì)與正電荷離子有親和力。根據(jù)細胞聚團的性質(zhì),可以添加螯合劑來溶解它們之間的粘連,而不會傷害細胞。乙二胺四乙酸(EDTA)是一種螯合劑,常用于溶解鈣粘連。
另一種細胞清除方法是氚化。氚化過程涉及到溫和、重復(fù)的吸管,以打破細胞間的弱粘。
如果預(yù)實驗比較緊急,或者細胞株較為珍貴,也可以在復(fù)蘇新細胞的同時,進行聚團細胞“拯救”。
可以將帶有聚團細胞的樣品低密度連續(xù)傳代,約三代過后,逐漸分散為獨立個體,再通過監(jiān)測細胞活力狀態(tài),判斷是否可用來進行下游實驗。若肉眼可見,即可直接通過清洗和吸出,或是在消化后將懸起的細胞樣品靜置數(shù)十秒以沉淀團塊。對于死細胞聚團,可以在細胞液中適量加入DNase以斷裂DNA。
常見細胞污染類型如何辨別及預(yù)防解決方法:細胞培養(yǎng)中常見的生物污染類型有7種,分別是細菌污染,支原體污染,原蟲污染,黑膠蟲污染,真菌污染,病毒污染以及非細胞污染,真菌污染來源,一般是來自實驗服,并且具有氣候性,多雨······
細胞聚團的原因分析及如何避免:培養(yǎng)物中細胞可能聚集的一些原因包括:1.過度消化、2.環(huán)境壓力、3.組織分解、4.過度生長、5.污染等;如何避免聚團細胞的生成;首先確認當前細胞生長密度及狀態(tài),80%左右的生長密度即可進行······
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