NK細胞高效擴增試劑盒說明書

產(chǎn)品介紹

采用自體外周血細胞中分離得到的單個核細胞，經(jīng)體外操作使 NK 細胞擴增活化，通過激活體內(nèi)免疫反應達到殺滅腫瘤細胞。本產(chǎn)品能夠?qū)⑼庵苎械膯蝹€核細胞大規(guī)模擴增成NK細胞，具有操作簡單，無需預包被，擴增效率高，目的細胞百分比高的特點，起始單個核細胞經(jīng)過14天培養(yǎng)，CD3-/CD56+NK細胞絕對數(shù)量可擴增達到1000倍，其純度可達80%以上。

產(chǎn)品信息

適用范圍

用于外周血或臍血體外誘導擴增NK細胞。

有效期：十二個月

樣本要求

單個核細胞存活率高于90%，新鮮外周血來源的單個核細胞總數(shù)建議控制在(20-25)×106個；臍血來源和凍存的外周血來源的單個核細胞總數(shù)建議控制在(25-30)×106個。

NK細胞分離培養(yǎng)操作步驟

1、所需主要試劑耗材

2、操作方法

2.1血液分離

血液樣本量25 mL 時， 實驗方法如下(需根據(jù)PBMC分離液的實際說明書進行調(diào)整)：

(1)取5支 15 mL 離心管， 各加入 5 mL PBMC分離液(與血液體積相同)。

(2)吸取血液樣本加于分離液之液面上， 800 g，離心 20 min，慢升慢降，若血液儲存超過2小時，請將離心時間增加至30 min。

(3)離心后，此時離心管中由上至下分為四層。第一層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個核細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。

分離圖例

2.2滅活自體血漿

(1)收集上層血漿到新的離心管中;

(2)56 ℃加熱血漿 30 min(可加8%葡萄糖酸鈣注射液混勻后共同滅活);

(3)室溫下，1200 xg 離心 10 min;

(4)用移液管將上清液收集至新的離心管，4 ℃保存，直至使用前取出。

2.3制備PBMC

(1)吸取第二層環(huán)狀乳白色單個核細胞層到另一 15 mL離心管中，向所得離心管中加入 10 mL 清洗液，混勻細胞。

(2)500 xg，離心 10 min，棄上清。

(3)重復洗滌3次，棄上清。

2.4 NK細胞擴增培養(yǎng)

(1)完全培養(yǎng)基的配制：分別添加500 μL NK 添加劑A、NK 添加劑B、NK 添加劑C、NK 添加劑D因子加入到2瓶1L基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(按照1:2000比例添加)。

(2)Day 0：用25 mL完全培養(yǎng)基重懸PBMC，加5%自體血漿，鋪于T75瓶中。

(3)Day 3: 補加25 mL培養(yǎng)基(含NK 添加劑A、NK 添加劑B、NK 添加劑C、NK 添加劑D因子)，加5%自體血漿，此時瓶子含50 mL培養(yǎng)基。一般情況下，培養(yǎng)液顏色發(fā)生變化或細胞較多時添加。

(4)Day 5: 往培養(yǎng)瓶中補加50 mL培養(yǎng)基(含NK 添加劑A、NK 添加劑B、NK 添加劑C、NK 添加劑D因子)，加5%自體血漿，轉(zhuǎn)入T225瓶中，此時瓶子含100 mL培養(yǎng)液。

(5)Day 7: 往瓶中補加150 mL培養(yǎng)基(含NK 添加劑A、NK 添加劑B、NK 添加劑C、NK 添加劑D因子)，另外往培養(yǎng)基中補加NK 添加劑E(按照NK 添加劑E因子與培養(yǎng)基的比例為1:2000添加)，細胞濃度控制在1.0×106 Cell/mL，加1%自體血漿，此時瓶中含250 mL 培養(yǎng)液，細胞轉(zhuǎn)袋前將培養(yǎng)瓶底部的細胞進行輕微吹散細胞，切勿劇烈吹打。

(6)Day 9: 往培養(yǎng)袋補加250 mL培養(yǎng)基(含NK 添加劑A、NK 添加劑B、NK 添加劑C、NK 添加劑D、NK 添加劑E因子)，加1%自體血漿，此時袋子含500 mL培養(yǎng)液。

(7)Day 11: 往培養(yǎng)袋補加500 mL培養(yǎng)基(含NK 添加劑A、NK 添加劑B、NK 添加劑C、NK 添加劑D、NK 添加劑E因子)，加1%自體血漿，此時袋子含1000 mL培養(yǎng)液。

(8)Day 13：往培養(yǎng)袋補加1000 mL培養(yǎng)基(含NK 添加劑A、NK 添加劑B、NK 添加劑C、NK 添加劑D、NK 添加劑E因子)，此時袋子含2000 mL培養(yǎng)液。

(9)推薦細胞濃度8-9天應控制在(1.0-1.5)×106 Cell/mL，第10-11天應控制在(1.5-2.0)×106 Cell/mL。

由于樣品個體差異、培養(yǎng)方式調(diào)整等因素，培養(yǎng)液體積會出現(xiàn)上下浮動，需要對NK細胞生長狀況進行觀察分析后，進行調(diào)整。

2.5 細胞收集

(1)培養(yǎng) 14 天，擴大培養(yǎng)成功后取樣檢測細胞表型、真菌、細菌、支原體、內(nèi)毒素等指標;

(2)收集培養(yǎng) 14 天后的細胞，將細胞懸浮液從培養(yǎng)袋轉(zhuǎn)入離心瓶，以 680 g 離心 10 分鐘;

(3)棄去細胞上清液，用含有 0.1%人血白蛋白的生理鹽水懸浮細胞，收集到一個離心瓶中。重復離心，清洗細胞 3 次;

(4)通過一次性細胞篩過濾，收集并注入含有 1%人血白蛋白的生理鹽水中。

性能展示

新鮮外周血樣本25ml，初始陽性率3%，培養(yǎng)14天后NK細胞絕對數(shù)量擴增達到1000倍，CD3-/CD56+比例達81.4%。

注意事項

1.血液采集建議使用肝素鈉抗凝管或枸櫞酸鈉采血袋。

2.自體血漿會影響細胞的培養(yǎng)狀態(tài)，建議自體血漿預留量為30 mL左右。溶血、高脂肪可能會影響NK細胞的擴增。

3.前7天補液時，必須將培養(yǎng)基進行室溫平衡或者水浴箱溫育培養(yǎng)基，避免低溫對細胞生長的影響。

4.細胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)前7天出現(xiàn)細胞成團屬于正?，F(xiàn)象，操作過程請注意不要破壞細胞團。

5.如果試劑外包裝管出現(xiàn)裂縫，應立即停止使用。

6.應嚴格按照貯存要求貯存。

7. 操作過程應在無菌環(huán)境下進行,必須保證操作過程中使用的所有容器及所有直接接觸細胞液的器具嚴格無菌。

8.本試劑開封后必須一次性使用完畢，不得反復凍融。

9.非最后的確定版本，隨著研究的進步，日后會繼續(xù)更新。

10.實驗過程中產(chǎn)生的洗滌液和各種廢棄物應根據(jù)相應法規(guī)和地方監(jiān)管部門要求進行處理。