產(chǎn)品描述

肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞是肝功能的基本組成單位，大約占肝臟體積及數(shù)量的80%左右，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞具有多方面的功能，例如：蛋白質(zhì)的合成和儲存、分泌膽汁和解毒物質(zhì)等。體外培養(yǎng)的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞是研究肝臟能量代謝、物質(zhì)合成、藥理毒性學(xué)良好模型。試劑盒采用二步灌流法，使得原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞從在體肝臟中消化，結(jié)合細(xì)胞純化液使用可快速純化得到小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。使用本試劑盒提取所得的小鼠肝原代實(shí)質(zhì)細(xì)胞純度>90.0%，純化后可直接進(jìn)行RT-qPCR、Western blot等基本生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，貼壁后可進(jìn)行藥理、病理、毒理學(xué)、免疫染色等實(shí)驗(yàn)操作。

適用范圍

該試劑盒適用于C57BL/6J、BALB/c等不同型號4周齡以上小鼠的原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞提取試劑盒。

運(yùn)輸和存儲條件

2-8 ℃保存與運(yùn)輸，保質(zhì)期為參考下表。所有組分開封后，有效期為 6-8 周，建議盡快使用。

配套培養(yǎng)基信息

表1. 試劑盒組成信息

分離步驟

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

將小鼠肝實(shí)質(zhì)灌注液Ⅰ、灌注液Ⅱ置于水浴鍋中加熱至37℃，備用。實(shí)驗(yàn)需自備注射器、靜脈留置針、手術(shù)器械、75 μm過濾篩、離心管若干。

一、肝臟灌注

1.麻醉并且固定小鼠，酒精噴灑清洗腹部。

2.剪開小鼠腹腔，沿肝臟上方剪開胸腔隔膜，使上腔靜脈暴露，用止血鉗夾住上腔靜脈。

3.撥開小鼠腸組織，暴露小鼠下腔靜脈和肝門靜脈，在下腔靜脈的位置插入靜脈留置針并固定好位置，輕輕拔出針芯，拔出時(shí)針管處有回血，此時(shí)外套軟管留在血管內(nèi)，進(jìn)行灌注。

4.將裝有肝實(shí)質(zhì)灌注液Ⅰ的注射器與靜脈留置針相連接，輕輕推動注射器，灌注液 Ⅰ 緩慢灌入，可見肝臟充盈，此時(shí)剪開門靜脈引流，保持灌流速度在5 mL/min至排盡肝臟內(nèi)血液、肝組織呈現(xiàn)蠟黃色為止。

5.換上肝細(xì)胞灌注液 Ⅱ，低速(3 mL/min)灌流，并節(jié)律性擠壓門靜脈切口(擠壓5-10s左右，間隔30s-1min,讓肝臟充盈，提高消化率)，持續(xù)消化5-15min不等，消化肝臟直至用棉簽按壓肝臟有塌陷感或者部分透明感，條紋樣的裂紋。

6.將肝臟沿著膈肌周圍整個(gè)剪下來，轉(zhuǎn)移到一個(gè)裝有細(xì)胞洗液的培養(yǎng)皿中。在超凈臺中用鑷子去除膽囊和肝臟外的包膜，輕輕抖動組織使肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞如流沙狀流出，未完全分散的部分用鑷子輕輕撥散至細(xì)胞洗液中。

二、肝實(shí)質(zhì)分離純化

1.用細(xì)胞洗液潤洗75 μm篩網(wǎng)，將上述步驟中的培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞濁液用寬頭吸頭或者巴氏管移至篩網(wǎng)上方過濾。

2.4℃、50 xg離心5分鐘。

3.小心棄去上清(低速離心后，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞以松散的方式沉在底部，棄上清時(shí)切勿吸力過大或者直接傾倒上清)，加入15 mL細(xì)胞洗液，用寬頭吸頭或者巴氏管輕輕重懸沉淀。

4.重復(fù)步驟2，小心棄去上清，加入5 ml細(xì)胞洗液重懸細(xì)胞沉淀。

5.依據(jù)細(xì)胞活率和數(shù)量配置30%-50%的活細(xì)胞純化液(純化液濃度越高，得到的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞活性越好，但與此同時(shí)，得到的細(xì)胞數(shù)量會減少，需要依據(jù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行取舍，如配置30% 細(xì)胞純化液配方為：細(xì)胞純化液：分離純化稀釋液 = 3:7)。將細(xì)胞懸液小心添加至兩倍體積的細(xì)胞純化液面上，細(xì)胞懸液與細(xì)胞純化液間應(yīng)產(chǎn)生明顯分層。

6.400 x g、4 ℃離心10分鐘(使用水平轉(zhuǎn)子，加速度減速度均為最低)。

離心完畢后離心管底部的沉淀即為純化后的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，用貼壁培養(yǎng)基重懸。

三、肝實(shí)質(zhì)分離純化

1.肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞種板前預(yù)先用 Ⅰ 型鼠尾膠原蛋白(以下簡稱鼠尾膠)鋪至培養(yǎng)器皿底部包被0.5-2 h(最長不超過6 h)，吸盡鼠尾膠，鼠尾膠可回收使用1-2次。

2.使用1 × PBS 清洗皿底后吸去PBS。

3.將細(xì)胞懸液按照3 x 105/ml細(xì)胞密度鋪至鼠尾膠包被的培養(yǎng)器皿中，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

4.4 h后顯微鏡下觀察，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞呈較大圓形、有明顯雙核結(jié)構(gòu)，將培養(yǎng)器皿內(nèi)的貼壁培養(yǎng)基更換為維持培養(yǎng)基。

注意事項(xiàng)

1.肝臟離體后建議在冰上操作，分散肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞時(shí)應(yīng)避免使用尖頭吸頭、過度重懸等操作導(dǎo)致細(xì)胞機(jī)械損傷。

2.肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在貼壁2-3天后分化明顯，建議在3天內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)。

3.肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞為不可傳代細(xì)胞，禁止使用胰酶等消化酶處理肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。

4.小鼠肝實(shí)質(zhì)灌注液 Ⅱ 中含有微生物生長所需的營養(yǎng)成分，請?jiān)诔瑑艄ぷ髋_內(nèi)打開，按照所需要量分裝，并且用封口膜封住瓶口，即取即用，以避免污染。