產(chǎn)品介紹

本產(chǎn)品iHHOs為hiPSC誘導(dǎo)分化肝類器官，該類器官由肝細(xì)胞組成囊泡狀結(jié)構(gòu)，成熟后的類器官具有肝干細(xì)胞和肝祖細(xì)胞的雙表型特征。在體外培養(yǎng)條件下可維持60天，并穩(wěn)定傳代擴(kuò)增、凍存和復(fù)蘇。

本產(chǎn)品需要操作人員具有細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，對類器官具有一定了解。

注意：本產(chǎn)品僅提供給進(jìn)一步科研使用，不可用于臨床治療等其他用途。

hiPSC誘導(dǎo)分化肝類器官iHHOs

實(shí)驗(yàn)儀器、材料

儀器：生物安全柜、細(xì)胞培養(yǎng)箱、水平式離心機(jī)、倒置顯微鏡、低溫冰箱、恒溫水浴鍋。

材料：24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、離心管(規(guī)格為15 mL 和 50 mL)、移液器(規(guī)格為 10 μL、100 μL、1000 μL)、無菌吸頭(規(guī)格為 10 μL、200 μL 和 1000 μL)、移液管(規(guī)格為10 mL、50 mL)。

鑒定結(jié)果

iHHOs為hiPSC誘導(dǎo)分化肝類器官操作步驟

iHHOs復(fù)蘇操作步驟

1. 基質(zhì)膠在4℃下解凍，恒溫水浴鍋37℃預(yù)熱，100 μL槍頭于-20℃預(yù)冷，194.8 mL iHHOs基礎(chǔ)培養(yǎng)基與5.2 mLiHHOs培養(yǎng)補(bǔ)充劑混勻制備iHHOs完全培養(yǎng)基。( 注意：配制iHHOs完全培養(yǎng)基需在2周內(nèi)用完，可將iHHOs培養(yǎng)補(bǔ)充劑分裝凍存，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要配制iHHOs完全培養(yǎng)基，避免反復(fù)凍融 )。

2. 將凍存管從液氮罐中取出，在37℃水浴鍋中快速解凍，當(dāng)剩少許浮冰時(shí)，取出，酒精消毒，轉(zhuǎn)移到生物安全柜中。

3. 將解凍好的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15離心管中，緩慢加入9mL復(fù)溫的DMEM/F12(含10 μM Y27632)，150g離心5min。

4. 去上清，加入30 μL基質(zhì)膠，均勻混合基質(zhì)膠-單細(xì)胞，用預(yù)冷槍頭將30 μL基質(zhì)膠加到孔中心，然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中，20-30min，使膠滴凝固。

5. 取出培養(yǎng)板，小心沿孔壁加入恢復(fù)室溫的700μL iHHOs完全培養(yǎng)基，注意不要碰到膠滴。注意：所用試劑除標(biāo)注“預(yù)冷”外，在使用前均需恢復(fù)至室溫。

6. 將孔板放到培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)，每兩天更換iHHOs完全培養(yǎng)基，每7-10天傳代。

iHHOs傳代操作步驟

1. 取出冷凍的基質(zhì)膠置于4℃解凍，并提前將槍頭放置在-20℃預(yù)冷1h。

2. 吸除培養(yǎng)基，加入1 mL預(yù)冷的PBS溶解基質(zhì)膠，將混合液轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中，300 g離心5 min，去除上層的PBS和基質(zhì)膠。

3. 加入1 mL Tryple(含1% BSA)，吹打5-8次，使類器官與Tryple充分接觸，接著轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中，靜置解離5min。

4. 5min后取出EP管，300g離心5min，去除上清，再加入1 mL DMEM/F12(含1% BSA)，吹打孔中混合物40-50次，使類器官團(tuán)徹底解離成單細(xì)胞，離心，去上清。

5. 用預(yù)冷槍頭按每孔30 μL的量在離心管中加入適量的基質(zhì)膠，吹打5-8次，均勻混合單細(xì)胞-基質(zhì)膠，注意吹打過程中避免產(chǎn)生氣泡。

3. 加入1 mL Tryple(含1% BSA)，吹打5-8次，使類器官與Tryple充分接觸，接著轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中，靜置解離5min。

6. 將提前放在培養(yǎng)箱中的24孔板取出，在孔中心位置加入30 μL膠滴， 緩慢打入混合液時(shí)，逐漸向上移動(dòng)槍頭，使細(xì)胞均勻分布在膠中。

7. 將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中，20-30min，使膠滴凝固。

8. 小心沿孔壁加入700 μL恢復(fù)室溫的 iHHOs完全培養(yǎng)基，注意不要碰到膠滴。

9. 將孔板放到培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)，每兩天更換iHHOs完全培養(yǎng)基，每7-10天傳代。

iHHOs凍存操作步驟

1. 將程序降溫盒放在-20℃中預(yù)冷1h。

2. 吸除培養(yǎng)基，加入1 mL預(yù)冷的PBS溶解基質(zhì)膠，將混合液轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中，300g離心5min，去除上層的PBS和基質(zhì)膠。

3. 加入1 mL Tryple(含1% BSA)，吹打5-8次，使類器官與Tryple充分接觸，接著轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中，靜置解離5 min。

4. 5 min后取出EP管，300 g離心5 min，去除上清。

5. 加入1 mL預(yù)冷的類器官凍存液(含10 μM Y27632)，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到凍存管中。

6. 將凍存管放到提前預(yù)冷的降溫盒中，將降溫盒轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱，過夜;隔天將降溫盒里的凍存管轉(zhuǎn)移到液氮罐中，長期保存。