ICLAC國際細(xì)胞系身份認(rèn)證委員會

全稱：國際細(xì)胞系身份認(rèn)證委員會(The International Cell Line Authentication Committee，簡稱ICLAC)

官網(wǎng)：https://iclac.org/

ICLAC簡介

國際細(xì)胞系認(rèn)證委員會 (International Cell Line Authentication Committee, ICLAC)成立于2012年。它的成立是為了幫助學(xué)術(shù)界發(fā)現(xiàn)更多的錯誤識別/被污染的細(xì)胞進(jìn)而避免在研究實驗中使用;同時進(jìn)一步提高科學(xué)家們的細(xì)胞鑒定意識以及推動細(xì)胞株鑒定成為科研實驗中的常態(tài)化工作。目前，ICLAC的合作組織或機(jī)構(gòu)有ATCC SDO、CCTCC、ECACC、JCRB等，它發(fā)布的相關(guān)指南與建議相當(dāng)具有權(quán)威性。

為什么細(xì)胞要進(jìn)行鑒定

以下為ICLAC細(xì)胞鑒定方面的指南與建議：

在開展細(xì)胞株相關(guān)的研究項目之前：

1)根據(jù)可靠的信息來源選擇所要使用的細(xì)胞株

根據(jù)細(xì)胞的基因型、表型以及起源等公開信息(包括組織或細(xì)胞類型、相關(guān)疾病、供體性別和年齡、供體祖籍背景)來選擇最適合進(jìn)行實驗研究的細(xì)胞株。Cellosaurus是查詢細(xì)胞株遺傳信息的很好的資源庫：https://www.cellosaurus.org/

2)查詢細(xì)胞株是否是已知的錯誤識別/被污染的細(xì)胞

由于交叉污染、標(biāo)簽標(biāo)記錯誤或其他原因，錯誤識別/被污染的細(xì)胞不再與其最初來源的遺傳信息保持一致。交叉污染最初只會導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)物混合，但是生長更快的污染細(xì)胞會逐漸取代原來的、真正的細(xì)胞株。ICLAC建立的Register of Misidentified Cell Lines可以幫助查詢：https://iclac.org/databases/cross-contaminations/

3)從可靠、規(guī)范的來源/單位獲取細(xì)胞株

細(xì)胞株應(yīng)該從原始來源獲?。阂词菣?quán)威的細(xì)胞庫，要么是細(xì)胞最初建系的實驗室或機(jī)構(gòu)。從二次來源獲取的細(xì)胞株，如實驗室間交換的細(xì)胞，有很大的風(fēng)險是錯誤識別/被污染的細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)每次要求供應(yīng)方提供細(xì)胞株已做過鑒定的證據(jù)，并檢查供應(yīng)方是否有信譽(yù)。

何時鑒定細(xì)胞是否為錯誤識別/被污染的細(xì)胞

4)實驗開展之前和論文投稿之前應(yīng)進(jìn)行細(xì)胞鑒定

當(dāng)細(xì)胞株建系時、細(xì)胞株進(jìn)入新實驗室時、準(zhǔn)備新的細(xì)胞庫時，都必須進(jìn)行細(xì)胞鑒定。如果將其用于實驗工作，細(xì)胞應(yīng)當(dāng)在實驗開展之前和實驗結(jié)束之后(即文章投稿之前)進(jìn)行鑒定。細(xì)胞株在長時間培養(yǎng)之后、發(fā)生任何遺傳修飾及選擇后以及表型發(fā)生變化時也應(yīng)當(dāng)及時進(jìn)行鑒定。

5)使用基于基因型分析的方法進(jìn)行細(xì)胞鑒定

由于細(xì)胞行為和表達(dá)模式會隨著細(xì)胞傳代和培養(yǎng)條件的變化而變化，因此基于表型分析的方法并不適合進(jìn)行細(xì)胞鑒定。進(jìn)行細(xì)胞鑒定的基因型分析方法可以區(qū)分不同來源的細(xì)胞株。基于基因型分析的合適的細(xì)胞鑒定方法包括：

a)STR(Short tandem repeat)分型。這是人源細(xì)胞鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)、共識方法，包括在實驗室間的結(jié)果比較時使用的最小STR基因座集合。STR分型這種方法也逐漸應(yīng)用到了小鼠細(xì)胞的鑒定。

b)SNP(Single nucleotide polymorphism)分型。這種方法并非是基于SNP的細(xì)胞鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法。但是，如果細(xì)胞通過STR分型被證明正確的，則這種方法可以用于內(nèi)部測試(例如，作為高通量測序分析的一部分)。已經(jīng)證明，幾組SNP位點能夠有效的對人源細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

6)將細(xì)胞鑒定結(jié)果與數(shù)據(jù)庫比對、以確定是否為錯誤識別/被污染的細(xì)胞

檢測錯誤識別/被污染的細(xì)胞取決于實驗室間結(jié)果的比較，這種比較需要包含很多不同細(xì)胞株(包括最有可能引起交叉污染的生長迅速的腫瘤細(xì)胞)STR數(shù)據(jù)的專業(yè)細(xì)胞數(shù)據(jù)庫。合適的細(xì)胞數(shù)據(jù)庫就包括Cellosaurus的STR Similarity Search Tool (CLASTR)：https://www.cellosaurus.org/str-search/

7)使用基于基因型的方法對細(xì)胞株進(jìn)行物種鑒定

如果某種細(xì)胞來源于STR分型或SNP分型不適用的物種，那么應(yīng)該進(jìn)行對細(xì)胞進(jìn)行物種鑒定。DNA條形碼技術(shù)是進(jìn)行細(xì)胞物種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)化、共識的方法，這種方法基于對線粒體基因細(xì)胞色素c氧化酶亞基1(通常稱為CO1, COI1或COX1)進(jìn)行測序。物種特異性多重PCR分析也可以快速確認(rèn)細(xì)胞的物種來源。另外，細(xì)胞遺傳學(xué)分析同樣可以用來進(jìn)行物種鑒定。

8)檢測微生物污染

所有細(xì)胞株應(yīng)當(dāng)進(jìn)行常見微生物污染的檢測，如支原體。還可能進(jìn)行病毒污染檢測，這具體取決于細(xì)胞株類型和研究實驗。

能夠看出，ICLAC關(guān)于細(xì)胞株鑒定的指南與建議十分詳盡。我們可以提取一些關(guān)鍵的信息作為參考：

1.在選擇細(xì)胞株之前，應(yīng)當(dāng)去ExPASy數(shù)據(jù)庫或ICLAC進(jìn)行檢索，查看細(xì)胞株的相關(guān)遺傳信息、查看是否為已知的錯誤識別或被污染的細(xì)胞。

2.要從可靠權(quán)威的單位購買細(xì)胞株，并要求供應(yīng)方提供相應(yīng)的細(xì)胞株身份證明(即便附帶供應(yīng)方的鑒定報告，細(xì)胞進(jìn)入實驗室時仍需再次進(jìn)行鑒定);盡量避免從二次來源的渠道(如實驗室間的交換細(xì)胞)獲取細(xì)胞株。

3.細(xì)胞株不僅要在實驗開始前、論文投稿前進(jìn)行鑒定;當(dāng)細(xì)胞長時間傳代培養(yǎng)后、發(fā)生任何遺傳修飾及選擇后以及表型發(fā)生變化時也應(yīng)當(dāng)及時進(jìn)行鑒定。

4.使用基于基因型分析的方法進(jìn)行細(xì)胞鑒定。相較SNP分型，更為推薦的是，作為金標(biāo)準(zhǔn)方法的STR分型。目前，STR分型也逐步應(yīng)用到小鼠細(xì)胞鑒定的工作中，相較于其他鼠類細(xì)胞，目前針對小鼠細(xì)胞鑒定的STR分型技術(shù)已經(jīng)相對成熟。

5.進(jìn)行STR鑒定的同時，須對細(xì)胞株進(jìn)行支原體檢測。

合理的庫存維持流程

科學(xué)家Mamie Yu給出了一種細(xì)胞系庫存維持建議的流程。每個步驟都需要質(zhì)量控制，以避免人為錯誤和污染。

在收到一個細(xì)胞系(原瓶)后，要對其進(jìn)行擴(kuò)增，最好是在一個單獨的超凈臺中，專門用于處理新的細(xì)胞系。將細(xì)胞系的信息儲存在數(shù)據(jù)庫中，做好記錄備份。對細(xì)胞進(jìn)行支原體和跨物種PCR分析的檢測，并使用STR和SNP指紋圖譜以確認(rèn)細(xì)胞身份。

初始擴(kuò)增后的細(xì)胞被存儲為“主儲備”，以保持細(xì)胞系的低傳代來源。然后對這些細(xì)胞進(jìn)行再次擴(kuò)增，檢測支原體，并作為“工作儲備”儲存起來。取其中一個樣本復(fù)蘇擴(kuò)增，以確定細(xì)胞的活力(解凍質(zhì)量控制)。在使用這些工作儲備前，仍需進(jìn)行支原體、跨物種污染檢測和SNP基因分型以控制質(zhì)量。在“工作儲備”超過“主儲備”的(最多)20倍之后，則需要棄用舊的“工作儲備”，從“主儲備”擴(kuò)增產(chǎn)生新的“工作儲備”。

同時，在任何階段的質(zhì)量控制失敗都需要重新檢測，因為可能會出現(xiàn)假陽性或樣品混淆的情況。在初始擴(kuò)增后，所有后續(xù)的重新擴(kuò)增或常規(guī)質(zhì)量控制，都要使用SNP平臺進(jìn)行監(jiān)測。將細(xì)胞系注釋與數(shù)據(jù)庫中的STR/SNP圖譜聯(lián)系起來，為將任何基于細(xì)胞的數(shù)據(jù)與原生細(xì)胞系聯(lián)系起來提供了基礎(chǔ)，從而有利于數(shù)據(jù)整合和比較。

防止細(xì)胞交叉污染的建議

盡管ICLAC提出的細(xì)胞株鑒定指南和建議十分詳盡，但仍可提取一些關(guān)鍵信息：

1. 開始實驗前：需要在權(quán)威數(shù)據(jù)庫(如ICLAC)進(jìn)行檢索，以查看細(xì)胞株相關(guān)遺傳信息、了解是否為已知的錯誤識別或污染。

2. 獲取細(xì)胞株：需要從可靠權(quán)威的單位購買，并要求供應(yīng)方提供相應(yīng)的細(xì)胞株身份證明，盡量避免從二手渠道(如實驗室間的交換)獲取細(xì)胞株。

3. 細(xì)胞株鑒定：在獲取細(xì)胞株保藏前、實驗開始前、論文投稿前、長時間傳代后、發(fā)生遺傳修飾/表型變化后均應(yīng)當(dāng)及時進(jìn)行鑒定。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備工作：根據(jù)已了解的細(xì)胞特性，提前準(zhǔn)備好合適的培養(yǎng)基和血清等，沿用此前的培養(yǎng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。

5. 避免交叉感染：

(1) 避免同時處理生長快和生長慢的細(xì)胞

(2) 在接觸細(xì)胞后，不要將移液管放回培養(yǎng)基或試劑瓶

(3) 避免氣溶膠在敞開的培養(yǎng)物間傳遞

(4) 避免使用未塞棉花的移液管

(5) 避免在凍存、復(fù)蘇和培養(yǎng)時錯誤標(biāo)記

(6) 必要時進(jìn)行細(xì)胞株鑒定和微生物(支原體、細(xì)菌、真菌等)污染檢測

(7) 定時觀察培養(yǎng)物狀態(tài)、保證檢測的真實有效

(8) 盡量避免共用培養(yǎng)基和(或)移液管

6. 細(xì)胞鑒定方法：可使用STR或SNP分型。

參考文獻(xiàn)

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