產品簡介

支原體是一類缺乏細胞壁的原核微生物，介于細菌和病毒之間，可在無生命培養(yǎng)基中生長繁殖，其結構簡單、個 體微小，形態(tài)成分枝狀或絲狀，能通過一般微孔濾膜(0.2-0.45 μm)。研究表明，至少二十多種支原體能污染細胞，其 中最常見的有：口腔支原體(M.orale)、精氨酸支原體(M. arginini)、豬鼻支原體(M. hyo rhinis)、發(fā)酵支原體 (M. fermentans)、人型支原體(M. hominis)、唾液支原體(M.salivarium)、肺支原體(M.pulmonis)和梨支原體 (M.pirum)等。培養(yǎng)細胞的支原體污染率在 4%-92%不等，其污染來源包括工作環(huán)境、操作者本身(一些支原體是人 體的正常菌群)、培養(yǎng)基、血清、細胞交叉污染、實驗器材和用來制備細胞的原始組織或器官的污染。確認細胞培養(yǎng)過 程中出現(xiàn)問題的潛在原因是一項困難且耗時的任務，在細胞培養(yǎng)中，任何突然的變化都應該被懷疑，同 時良好的試驗規(guī)范和定期檢測支原體污染也十分必要。支原體檢測的方法有很多種，如直接培養(yǎng)、DNA 熒光染色、ELISA 和 PCR 法等。 本產品通過PCR方法檢測培養(yǎng)細胞等生物材料中的支原體，針對支原體16SrRNA序列保守區(qū)域設計特異引物， 直接使用細胞培養(yǎng)液作為模板，特異性擴增支原體DNA，具有操作簡便、快速(2小時內即可出結果)、特異性強、靈敏 度高的特點(結果見圖1、圖2)。

1、陰性對照 2、陽性對照

3、細胞培養(yǎng)液原液 4、1：1稀釋細胞培養(yǎng)液;

5、1:5稀釋細胞培養(yǎng)液 6、1:10稀釋細胞培養(yǎng)液

7、1:20稀釋細胞培養(yǎng)液 8、1:50稀釋細胞培養(yǎng)液);

9、1:100稀釋細胞培養(yǎng)液 10、1:200稀釋細胞培養(yǎng)液;

11、1:400稀釋細胞培養(yǎng)液; 12、1:800稀釋細胞培養(yǎng)液

13、1：1000稀釋細胞培養(yǎng)液 ; 14、稀釋液(陰性對照)

產品信息

試劑盒組成

PCR支原體檢測試劑盒操作步驟

1.樣品制備

a.貼壁細胞

待細胞培養(yǎng)2-3天，生長至匯合度80%左右時，取40 μL細胞培養(yǎng)液放入干凈的PCR管中，置于PCR儀中95℃熱處理10 分鐘后用作PCR模板。

b.懸浮細胞

待細胞培養(yǎng)2-3天，密度達到106/mL左右時，2,000 xg離心1分鐘，取40 μL細胞培養(yǎng)液放入干凈的PCR管中，置于PCR 儀中95 ℃ 熱處理10分鐘后用作PCR模板。

注:未進行熱處理或者熱處理后的樣品可以放置在-20 ℃穩(wěn)定保存1個月以上。培養(yǎng)時間特別長(4天以上)的細胞培養(yǎng)

液，建議用Myco Free Water 10倍稀釋細胞培養(yǎng)液后再檢測。

 c.血清

用Myco Free Water將血清稀釋20倍后，取40 μL放入干凈的PCR管中，置于PCR儀中95℃熱處理10分鐘后用作PCR 模板。

2.PCR

按以下順序配制反應混合液，設置陰性對照(Myco Free Water)與陽性對照(Myco Positive Control Template)，嚴 格操作，防止外源支原體污染。

PCR體系(20 μL)

3.PCR循環(huán)

4.凝膠電泳

反應結束，取10 μLPCR產物，進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，檢測PCR結果。

5.通過與陽性對照、陰性對照檢測結果比較，確認樣品支原體污染情況，陽性條帶大小大約350 bp。

 注：如果陰性對照出現(xiàn)條帶，很有可能是體系污染，建議重新檢測確認結果。

推薦使用頻率

PCR支原體檢測試劑盒注意事項

1.試劑在使用前徹底化凍、混勻(混勻時禁止激烈振蕩，只需要進行上下倒置多次進行混勻)。 2.細胞培養(yǎng)物中含有的青霉素和鏈霉素等抗生素以及血清不會影響本產品的檢測結果。

3.操作時應盡量少說話，因口腔中也含有支原體，可能引起樣品污染，而造成假陽性;整個檢測過程中，反應體系的配 制、樣本處理及加樣、PCR 擴增應分區(qū)域進行，以避免交叉污染。

4. PCR 反應極其靈敏，為防止假陽性，加樣時，最后加陽性對照。

5.細胞培養(yǎng)物中含有青霉素和鏈霉素等抗生素不會影響本品的檢測結果。如果用戶需要進一步提高檢測靈敏度，建 議細胞在不含青霉素和鏈霉素等抗生素中進行培養(yǎng) 2-3 天后送樣檢測。