在生物醫(yī)學(xué)研究和藥物開發(fā)領(lǐng)域，生物發(fā)光成像技術(shù)因其高信噪比而被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞測定和動物成像研究。然而，傳統(tǒng)的熒光素酶種類有限，限制了同時成像多個分子和細(xì)胞事件的能力。為了突破這一限制，科學(xué)家們開發(fā)了一種新型的ATP非依賴性熒光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海蝦Oplophorus gracilirostris，并經(jīng)過工程改造以增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。NanoLuc作為一種小型(19 kDa)、高亮度的熒光素酶，其亮度是傳統(tǒng)螢火蟲或海腎熒光素酶的100倍，并且使用furimazine作為底物產(chǎn)生明亮的輝光型發(fā)光。

NanoLuc的意義在于其為雙報(bào)告基因生物發(fā)光分子成像提供了新的可能。它不僅可以在活體小鼠的表層和深層組織中成像，而且其生物發(fā)光隨時間的變化可以用來定量腫瘤生長，甚至在少量血清中也能檢測到分泌的NL。此外，NanoLuc與螢火蟲熒光素酶的結(jié)合使用，為在完整細(xì)胞和活體小鼠中定量TGF-β信號傳導(dǎo)的兩個關(guān)鍵步驟提供了一種新型雙熒光素酶成像策略，從而在正常生理、疾病和藥物開發(fā)中擴(kuò)展了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的成像能力。NanoLuc的作用不僅體現(xiàn)在其高靈敏度和高穩(wěn)定性上，它還具有更小的尺寸，這使得在標(biāo)記細(xì)胞和蛋白質(zhì)時對樣本的侵入性更小，有助于保持細(xì)胞或組織的天然狀態(tài)。NanoLuc的快速反應(yīng)、低背景發(fā)光和多樣靈活等特點(diǎn)，使其在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。因此，NanoLuc作為一種新的報(bào)告基因，不僅增強(qiáng)了我們對生物過程的理解和疾病機(jī)理的研究，而且在開發(fā)潛在治療方法和療法方面發(fā)揮了重要作用。

基本信息

英文標(biāo)題：An optimized luciferin formulation for NanoLuc-based in vivo bioluminescence imaging

中文標(biāo)題：基于NanoLuc的體內(nèi)生物發(fā)光成像優(yōu)化熒光素配方研究

發(fā)表期刊：《Scientific Reports》

影響因子：3.8

作者單位：

1.Promega Corporation, San Luis Obispo, CA, USA

2.Department of Bioengineering, Stanford University, Stanford, CA, USA

3.Promega Corporation, Madison, WI, USA

作者信息：Chao Gao, Yan Wu, Connor Fitzgerald

研究背景

生物發(fā)光成像(BLI)因其非侵入性、高靈敏度和低成本被廣泛用于臨床前研究，但現(xiàn)有海洋型熒光素(如coelenterazine衍生物)存在溶解度低、毒性高和腦部滲透性差等問題。NanoLuc是一種高亮度的海洋熒光素酶，但其底物furimazine(Fz)類似物在體內(nèi)應(yīng)用中受限于溶解度和安全性。本研究旨在優(yōu)化NanoLuc底物配方，通過改進(jìn)底物結(jié)構(gòu)(設(shè)計(jì)新型CFz9)和篩選緩沖液體系，提升底物的溶解性、穩(wěn)定性及生物相容性，同時降低輔料Poloxamer-407(P-407)的毒性，以實(shí)現(xiàn)高效、安全的體內(nèi)生物發(fā)光成像，尤其針對腦部應(yīng)用。

研究方法

1. 底物設(shè)計(jì)與合成：合成氟化衍生物CFz9，通過LC-MS和紫外吸收法比較其與CFz的溶解度差異。

2. 緩沖液篩選：測試水、生理鹽水、Tris(不同pH)等10種緩沖液對CFz9/P-407復(fù)溶后穩(wěn)定性(溶解度和純度)的影響。

3. 毒性評估：通過小鼠體重監(jiān)測、血液生化指標(biāo)(膽固醇、甘油三酯)和器官組織病理學(xué)分析，評價(jià)高劑量CFz9(4.2 μmol)及輔料P-407的毒性。

4. 體內(nèi)BLI驗(yàn)證：在轉(zhuǎn)基因小鼠(肝臟和腦部表達(dá)Antares熒光素酶)中對比CFz9與FFz的成像亮度及穩(wěn)定性，分析復(fù)溶后時間對信號強(qiáng)度的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1：氟化修飾顯著增強(qiáng)CFz9的溶解性能

通過化學(xué)結(jié)構(gòu)改造，CFz9在苯環(huán)C8位引入氟原子(圖1a)，其溶解度在PBS中較CFz提升3倍以上(圖1b)。紫外吸收法(850 nm)顯示，CFz9在無輔料條件下的臨界溶解濃度為1.5 mM，而CFz僅0.5 mM即出現(xiàn)沉淀。這一改進(jìn)使得CFz9在高劑量(4.2 μmol)注射時輔料P-407用量從20 mg降至12 mg，降低了毒性風(fēng)險(xiǎn)。此外，CFz9在腦部的摩爾亮度與CFz相當(dāng)，支持其作為替代底物的可行性。

圖2：Tris(pH 8.0)緩沖液實(shí)現(xiàn)CFz9復(fù)溶后長效穩(wěn)定

通過LC-MS分析10種緩沖液對CFz9/P-407復(fù)溶后穩(wěn)定性的影響(圖2a-c)。結(jié)果顯示，DPBS(pH 7.0)和碳酸氫鹽緩沖液(pH 9.0)導(dǎo)致CFz9快速降解(6小時后純度<80%)，而Tris(pH 8.0)緩沖液在6小時內(nèi)維持溶解度和純度>90%。進(jìn)一步延長至10小時，仍有70%底物保持溶解狀態(tài)(圖S1)。該緩沖液的弱堿性可能抑制氧化反應(yīng)，為體內(nèi)注射提供了穩(wěn)定的時間窗口(推薦復(fù)溶后6小時內(nèi)使用)。

圖3：高劑量CFz9連續(xù)注射未引發(fā)器官損傷

C57BL/6小鼠連續(xù)3天注射高劑量CFz9(4.2 μmol)后，體重波動<5%(圖3a)，血液生化顯示總膽固醇和甘油三酯短暫升高(表S1)，但組織病理學(xué)分析(心、肝、腎、腦)未發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)性損傷(圖3b)。相比之下，傳統(tǒng)CFz配方曾導(dǎo)致肝臟巨噬細(xì)胞囊泡積累。結(jié)果表明，CFz9通過減少輔料用量和優(yōu)化緩沖體系，顯著提升了生物相容性，適用于重復(fù)給藥的長時程研究。

圖4：CFz9在腦部與肝臟成像中媲美商業(yè)底物FFz

在表達(dá)Antares熒光素酶的轉(zhuǎn)基因小鼠中，CFz9與FFz的峰值信號強(qiáng)度無顯著差異(圖4a-b)，但CFz9信號衰減稍快(半衰期縮短15%)。腦部成像實(shí)驗(yàn)顯示，復(fù)溶后6小時內(nèi)的CFz9信號強(qiáng)度保持穩(wěn)定(圖4c-d)，24小時后降至25%。該結(jié)果表明，CFz9在腦滲透性和信號持久性上達(dá)到應(yīng)用要求，且成本可能低于商業(yè)化的FFz，為NanoLuc系統(tǒng)提供了高性價(jià)比的替代方案。

研究結(jié)論

1. 底物優(yōu)化：CFz9的溶解度較CFz提升3倍，輔料P-407用量減少40%，且Tris(pH 8.0)緩沖液可維持復(fù)溶后6小時內(nèi)穩(wěn)定性(純度>90%)。

2. 安全性提升：高劑量CFz9(4.2 μmol)連續(xù)注射3天未引發(fā)器官損傷，僅短暫性血脂升高，毒性顯著低于傳統(tǒng)配方。

3. 成像性能：CFz9在腦部和肝臟的峰值亮度與FFz相當(dāng)，且復(fù)溶后6小時內(nèi)信號無衰減，支持其在長時程研究中的應(yīng)用。

4. 應(yīng)用價(jià)值：優(yōu)化配方為NanoLuc系統(tǒng)提供了更安全、高效的體內(nèi)成像工具，尤其在腦部動態(tài)監(jiān)測和藥物遞送研究中潛力顯著。