產品簡介

Cell Counting Kit-8，簡稱CCK-8(或CCK8)試劑盒，是一種基于WST-8(化學名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速、高靈敏度檢測試劑盒。其檢測原理在于，在電子耦合試劑存在的情況下，檢測試劑中的WST-8化合物被活細胞內脫氫酶還原成具有水溶性的橙黃色甲臜化合物,該物質在450 nm處有最大吸收峰。甲臜量與活細胞數成正比，即細胞增殖越多越快，則顏色越深;細胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數目呈線性關系。

WST-8是MTT的一種升級替代產品，和MTT或其它MTT類似產品如XTT、MTS等相比有明顯的優(yōu)點。首先，MTT 被線粒體內的一些脫氫酶還原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液來溶解;而WST-8和XTT、MTS產生的formazan都是水溶性的，可 以省去后續(xù)的溶解步驟。其次，WST-8產生的formazan比XTT和MTS產生的formazan更易溶解。再次，WST-8比XTT和MTS更加穩(wěn)定，使實驗結果更加穩(wěn) 定。另外，WST-8和MTT、XTT等相比線性范圍更寬，靈敏度更高。WST-8和WST-1相比，檢測靈敏度更高，更易溶解，并且更加穩(wěn)定。

本試劑盒中WST-8對細胞無明顯毒性，可以用于外源細胞因子等誘導的細胞增殖檢測，以及藥物等對細胞有毒試劑誘導的細胞毒性檢測，或一些藥物誘導的細胞生長抑制檢測，是MTT檢測方法的升級版。 本試劑盒使用便捷，無需配制或稀釋，無需收集或洗滌細胞，無需對甲臜化合物進行再次溶解，對貼壁細胞及懸浮細胞均適用。且酚紅和血清對本試劑盒的測定無明顯影響。

產品信息

CCK-8使用說明

1.制作標準曲線(測定細胞具體數量)

(1)先用細胞計數板計數所制備的細胞懸液中的細胞數量，然后接種細胞到培養(yǎng)板內。

(2)按比例(例如：1/2比例)依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做3-5個細胞濃度梯度，每個濃度建議3-6個復孔。

(3)接種后培養(yǎng)2-4小時使細胞貼壁，然后加CCK-8試劑培養(yǎng)一定時間后測定OD值，制作出一條以細胞數量為橫坐標(X軸)，OD值為縱坐標(Y軸)的標準曲線。根據此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數量(使用此標準曲線的前提是實驗的條件要一致，便于確定細胞的接種數量以及加入CCK-8后的培養(yǎng)時間。)

2.細胞活性檢測

(1)在96孔板中接種細胞懸液(100 μL/孔)。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)一段時間(37℃,5% CO2)。

(2)向每孔加入10 μL CCK-8溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數)。

(3)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內孵育1-4小時。

(4)用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

(5)若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時內測定，吸光度不會發(fā)生變化。

3.細胞增殖-毒性檢測

(1)在96孔板中配制100 μL的細胞懸液。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預培養(yǎng)24小時(37℃， 5% CO2)。

(2)向培養(yǎng)板加入10 μL不同濃度的待測物質。

(3)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當的時間(例如：6、12、24或48小時)。

(4)向每孔加入10 μL CCK-8溶液(注意不要再孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數)。

(5)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內孵育1-4小時。

(6)用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

(7)若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時內測定，吸光度不會發(fā)生變化。

注意：如果待測物質有氧化性或還原性的話，可在加CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基(除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基)，去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。

4.活力計算

細胞活力(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[ A(0 加藥)-A(空白)]×100

A(加藥)：具有細胞、CCK-8 溶液和藥物溶液的孔的吸光度

A(空白)：具有培養(yǎng)基和 CCK-8 溶液而沒有細胞的孔的吸光度

A(0 加藥)：具有細胞、CCK-8 溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度

CCK-8試劑盒注意事項

1.本試劑盒檢測原理是依賴于脫氫酶催化的反應，樣品中如有較多還原劑(例如一些抗氧化劑)會干擾檢測，需設法去除。

2.建議先做幾個孔摸索接種細胞的數量和加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時間。

3.白細胞可能需要培養(yǎng)較長時間。

4.當使用標準96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為 1 ,000 個/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于 2,500 個/孔 ( 100 μL 培養(yǎng)基)。如果要使用 24 孔板或 6 孔板實驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的 10% 加入 CCK-8 溶液。

5.如果沒有 450 nm 的濾光片，可以使用吸光度在 430-490 nm 之間的濾光片，但是 450 nm 檢測靈敏度最高。

6.培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。

7.由于使用96孔板進行檢測，如果細胞培養(yǎng)時間較長，一定要注意蒸發(fā)問題。一方面，由于96孔板周圍一圈 最容易蒸發(fā)，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加相同量的PBS、水或培養(yǎng)液;另一方面，可以把96孔板置于靠近培養(yǎng)箱內水源的地方，以緩解蒸 發(fā)。

8.加檢測試劑時避免產生氣泡，否則會干擾檢測結果。

9.本產品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。

10.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

本產品僅用于科研用途，不可用于診斷、治療、臨床、家庭及其他用途。