細(xì)胞簡(jiǎn)介

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分離自臍帶組織，它是臍靜脈的重要結(jié)構(gòu)組成細(xì)胞之一，在機(jī)體的正常生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。臍帶是哺乳類的連接胎兒和胎盤的管狀結(jié)構(gòu)，臍帶中通過(guò)尿膜的血管即臍動(dòng)脈和臍靜脈，卵黃囊的血管即臍腸系膜動(dòng)脈及臍腸系膜靜脈。在子宮中，子宮動(dòng)脈在胎盤的母體部分出的毛細(xì)血管，與胎盤的子體部胎兒毛細(xì)血管靠近，在此處母體和胎兒的血液間進(jìn)行CO2和O2，代謝產(chǎn)物即代謝廢物和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換。臍動(dòng)脈將胎兒產(chǎn)生的廢物運(yùn)送至胎盤，臍靜脈將O2和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從胎盤運(yùn)送給胎兒

細(xì)胞特點(diǎn)

原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具有很好的增殖能力和分化能力，能夠分化為多個(gè)不同的細(xì)胞類型，例如成血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等。此外，原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的受體和分泌的因子廣泛參與了許多重要的體內(nèi)生理過(guò)程，例如血管形成、血液循環(huán)調(diào)節(jié)、血小板聚集等。這也使得原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在治療許多疾病時(shí)顯示出了廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞原代分離，鑒定及培養(yǎng)

材料準(zhǔn)備

試劑：PBS，胰酶，ECM完全培養(yǎng)基，HUVEC專用消化酶，臍帶運(yùn)輸保存液

器械：注射器，手術(shù)鉗，T25培養(yǎng)瓶，玻璃大皿，灌胃針

操作流程

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

提前將使用手術(shù)鉗，灌胃針及玻璃大皿高溫滅菌，準(zhǔn)備所需要的分離試劑。

1.將 15-20 cm 長(zhǎng)的新生兒臍帶放入無(wú)菌的 PBS 溶液(添加雙抗和肝素鈉)中儲(chǔ)存。(注：4℃下最多貯存 24 小時(shí)，室溫下不超過(guò) 6 小時(shí)，否則廢棄)

2. 使用50ml注射器，每次可以灌滿新鮮PBS后可以用止血鉗夾住臍帶兩端，輕緩揉捏，將臍帶內(nèi)的血塊化開，方便沖洗干凈。

3. 用手術(shù)鉗夾緊臍帶下端，加入 15 mL (灌滿為標(biāo)準(zhǔn))的HUVEC專用消化酶，室溫下消化 15-20分鐘，有條件的話放置到37攝氏度的環(huán)境中，消化期間經(jīng)常翻動(dòng)臍帶，使酶溶液在血管內(nèi)流動(dòng)，促使內(nèi)皮細(xì)胞與酶均勻接觸。

4. 消化完后，先用鈍頭針頭疏通下端流出口，防止阻塞，將下端手術(shù)鉗松開，消化液流入一個(gè) 50 mL 無(wú)菌離心管中，管內(nèi)要有部分全培養(yǎng)基，或者純血清，用無(wú)菌的 PBS 溶液沖洗臍帶2-3次，每次都要用手輕微揉動(dòng)。

5. 將收集液，置于離心機(jī)1000 rpm 離心3分鐘。

6. 倒去上清，加入 10 mL ECM培養(yǎng)基，用巴氏管吹散細(xì)胞，將所有液體轉(zhuǎn)入T25培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)。

7. 培養(yǎng)24小時(shí)后，倒掉培養(yǎng)基，并用無(wú)菌的 PBS 溶液清洗2-3次，洗掉紅細(xì)胞和死細(xì)胞，加入10 mL新鮮的ECM培養(yǎng)基。

8. 以后每2天換一次培養(yǎng)基(每次換掉 2/3 的培養(yǎng)基)。

9. 一般培養(yǎng)5-7天，細(xì)胞可長(zhǎng)滿至 80-90%單層，這時(shí)可以傳代。

細(xì)胞傳代

1. 倒掉培養(yǎng)基，用無(wú)菌的PBS溶液清洗2-3次，加入2- 3 mL 消化液(0.25% 胰酶+0.1% EDTA)消化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察，一旦細(xì)胞變圓，即加入2-3倍的有血清的DMEM培養(yǎng)基終止反應(yīng)。

2. 用巴氏管將細(xì)胞吹打下來(lái)，并將所消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè) 50 mL無(wú)菌離心管中，置于離心機(jī)1000 rpm離心 3 分鐘。

3. 倒掉上清，加入 10 mL新鮮培基，一般一瓶細(xì)胞可傳代 3-4 瓶，以后照此傳代培養(yǎng)。

4. 一般傳代 2-3 代(培養(yǎng)了 20 天左右)用于做各種實(shí)驗(yàn)效果最好。P6代以內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果收到認(rèn)可。

細(xì)胞鑒定

1. 形態(tài)學(xué)觀察

細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈短梭形或鋪路石樣向前排列，上皮細(xì)胞樣。

2. 標(biāo)記物檢測(cè)

一般的標(biāo)準(zhǔn)為VWF,CD31,VIMTENMIN為陽(yáng)性(>95%)

3. 誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)

成管實(shí)驗(yàn)

HUVEC細(xì)胞標(biāo)志物熒光鑒定

HUVEC成管實(shí)驗(yàn)