hPSC定向誘導三胚層實驗(單層法)視頻教程

背景介紹

干細胞作為一種具有自我更新和多向分化能力的細胞，是醫(yī)學研究上用來研究組織和器官再生、藥物篩選，調(diào)控細胞命運轉(zhuǎn)換以及動物發(fā)育分子機制的良好模型。從2007年，3位科學家以“利用胚胎干細胞把特定基因改性引入實驗鼠的原理”獲得“諾貝爾生理學或醫(yī)學獎”，到2012年日本山中伸彌博士因“發(fā)現(xiàn)成熟細胞可以被重新編程誘導成為多能干細胞及戈登爵士的克隆生物學發(fā)現(xiàn)”再次斬獲“諾貝爾生理學或醫(yī)學獎”無一不證明了“20世紀是藥物治療的時代，21世紀是細胞治療的時代”。

基于hPSC的多能干性，體外環(huán)境下，hPSC可以在多種細胞因子或小分子藥物的相互作用下，可分化形成內(nèi)、中、外3個胚層。進而可以體外模擬人胚發(fā)育，構(gòu)建模擬標準化的人體細胞、組織和器官。同時非先啟動及特異性分化的胚層誘導也是驗證hPSC分化能力的重要實驗方法。

實驗介紹

Tri-embryonic differentiation kit三胚層分化試劑盒提供了一種簡單的誘導方案，可使人胚胎干(ES)和誘導的多能干(iPS)細胞向三個胚層分化的能力 神經(jīng)性外胚層，中胚層和內(nèi)胚層。該試劑盒包括專門的單一體系培養(yǎng)基和基于單層誘導(無需形成EB)的方案，對每個胚層進行平行的體外定向分化實驗，在一周內(nèi)清楚地、可重復地建立三系分化潛力。

準備工作

Stem&Easy 即用鋪板液鋪板12孔板、準備好冷藏的Stem&Easy Planking solution，吸取6ml鋪板液，每孔加入500ul，十字搖勻后4度過夜冷藏或者常溫放置2小時后使用。

此步驟推薦產(chǎn)品

Stem&Easy系列：Planking Solution 32ml

階段1：hPSCs的培養(yǎng)及內(nèi)胚層的直接誘導-以IMMOCELL -ESC(H9)細胞系為例

1、取狀態(tài)良好，匯合度75-80%的ESC經(jīng) 常溫的DPBS洗滌1-2次后，用immocell hPSC 溫和消化液+RI 消化7-8分鐘后，用1ml hPSC完全培養(yǎng)基終止消化，收集于1.5ml離心管中。

2、取10ul細胞懸液加入臺盼藍，(不用觀測)測試細胞活力和數(shù)量，匯合度在8成的單個6孔板消化后細胞密度平均為100000，分別加入10ml DE d 抑制劑和20ml hPSC完全培養(yǎng)基+ROCK抑制劑稀釋到100000和50000個細胞左右。

3、準備3個用Stem&Easy 即用鋪板液鋪板的常規(guī)12孔板(鋪板后需在4度過夜),在不破壞基質(zhì)的情況下小心吸取5-10孔的上清，盡管體系的不同細胞密度，但是每孔依舊加入2ml細胞懸液。

總的來說，內(nèi)胚層直接誘導的12孔板中有5孔誘導體系，而20ml稀釋的懸液體系有10孔，用于中、外胚層的誘導。

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階段2：中胚層誘導及中、內(nèi)觀察

1、將上述接種好的細胞十字搖勻后，置于常規(guī)細胞培養(yǎng)箱。其中內(nèi)胚層為優(yōu)化的直接誘導體系，從接種到成熟只要4天，成熟的內(nèi)胚層譜系細胞排列及其緊密。(如下)

2、中、外胚層的誘導體系和hPSC的E8培養(yǎng)體系差異過大，直接誘導細胞容易出現(xiàn)應(yīng)激而不貼壁，中胚層建議貼壁1D后開始誘導。

3、觀察未加誘導液細胞的生長狀態(tài)和克隆密度，貼壁1天后細胞克隆密度達到30%,可以進行中胚層誘導。吸取上清的hPSC完胚后，用減血清DMEM/F12洗滌一遍后每孔加入1ml的MD differentiation Medium+ROCK抑制劑，中胚層誘導過程會有大量細胞漂浮，為正?，F(xiàn)象，約5天后中胚層細胞譜系達到70%的匯合率，細胞形態(tài)類似間充質(zhì)細胞，呈現(xiàn)纖維狀。(如下)

階段3:神經(jīng)外胚層誘導

1、外胚層由神經(jīng)外胚層、神經(jīng)嵴(neural crest, NC)、顱基板(cranial placode, CP)和非神經(jīng)外胚層四種主要的外胚層譜系所組成，每個外胚層譜系誘導方案不同，本方案主要誘導NC外胚層。

2、在hPSC貼壁2天后細胞克隆密度達到60-70%,吸取上清的hPSC培養(yǎng)基，用減血清DMEM/F12洗滌一次后每孔加入2ml的NeuroED differentiation Medium+ROCK抑制劑及10ul的NC 補充液A和10ul的NC補充液B誘導2天向1階段外胚層譜系誘導。

3、1階段誘導結(jié)束后吸棄上清加入2ml的NeuroED differentiation Medium和8ul的NC補充液A,誘導6-12天，每兩天換液一次，6天后外胚層譜系細胞狀態(tài)呈現(xiàn)神經(jīng)元細胞狀，且每天都有許多細胞漂浮，為正常現(xiàn)象，按時換液即可。

系列/方案iPSCs細胞擴增三胚層誘導其他試劑

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