NK細胞介紹

NK細胞(natural killer cell, NK)通常被稱作自然殺傷細胞，無須抗原預先致敏即可直接殺傷某些靶細胞，包括腫瘤細胞、病毒或細菌感染的細胞。

NK細胞是機體重要的天然免疫細胞之一，主要存在于脾臟和外周血中。當感染首次發(fā)生時，NK細胞能主動出擊，殺死被感染的細胞，因此也被稱為“天然殺手”。

人外周血NK細胞分離培養(yǎng)

本實驗室采用獨有的細胞因子培養(yǎng)法，將外周血中的單個核細胞進行誘導，經(jīng)過14天的誘導培養(yǎng)，CD3-/CD56+NK細胞絕對數(shù)量可擴增達到1000倍，其純度可達80%以上。

優(yōu)勢

1.無需預包被，操作簡單；

2.擴增效率高；

3.目的細胞百分比高的特點。

實驗前準備

(1)提前開啟紫外線照射超凈臺30min。

(2)紫外照射完畢后，75%酒精消毒超凈臺，超凈臺通風10min以上。

(3)水浴鍋提前開啟，加熱至56攝氏度;

(4)KBM-581培養(yǎng)基、IL-2提前從冰箱取出，放至室溫。

試劑耗材

試劑：人PBMC細胞分離液、清洗液、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、581培養(yǎng)基(圖片)

耗材：10ml移液管，15ml離心管，采血管，T75培養(yǎng)瓶(圖片)

儀器;離心機、CO2培養(yǎng)箱、冰箱、顯微鏡(圖片)

人外周血NK細胞實驗步驟

(一)單個核細胞分離

血液樣本量10mL 時， 實驗方法如下：

第一步：鋪血

1. 取2支 15mL 離心管， 各加入 5mL 分離液(與血液體積相同)。

2. 用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上;

第二步：離心

3.500xg，離心 20min。(分離PBMC時離心轉(zhuǎn)速設(shè)置為慢升慢降，升為9，降調(diào)為0;)

4. 離心后，此時離心管中由上至下分為四層。第一層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個核細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。(分層圖片)

第三步：血漿滅活

5. 收集血漿到新的離心管中;血漿56攝氏度30min滅活，900xg離心10min，取上清，置于-20℃，15min，再次900xg離心10min，取上清，置于4℃保存。

第四步：分離單個核細胞

6. 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個核細胞層到另一50mL離心管中，向所得離心管中加入10mL 清洗液，混勻細胞。

第五步：清洗

7 . 300xg，離心 10min。

8 . 棄上清。

9. 用吸管以 10mL 清洗液重懸所得細胞。

10. 300xg，離心 10min。

11. 重復 7、 8、 9，棄上清后以 0.5mL (根據(jù)實驗需要重懸體積不等)后續(xù)實驗所需相應(yīng)液體重懸細胞。

(二)NK細胞培養(yǎng)

1. D0 ：將制備好的單個核細胞(PBMC)重懸，按細胞密度1.0-2.0M cells/mL鋪于T-25瓶中。約用10ml 581培養(yǎng)基，培養(yǎng)基加入因子IL-2 (1000 U/mL)、IL-12(20 ng/mL)、IL-15 (20 ng/mL)、IL-18(100ng/mL)和5%自體血漿。

2. D4 ：補加10ml培養(yǎng)基(含IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和5%自體血漿)，此時瓶子含20mL培養(yǎng)基。

3. D6： 補加20ml培養(yǎng)基(含IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和5%自體血漿)，此時瓶里含有40ml培養(yǎng)基。

4. D8 ：往培養(yǎng)瓶補加40ml培養(yǎng)基(含IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和5%自體血漿)，同時加入IL-21(50 ng/mL)，此時瓶子含80mL 培養(yǎng)液。

5. D10：往培養(yǎng)瓶補加80ml培養(yǎng)基(含因子IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和5%自體血漿)，此時瓶子含160mL 培養(yǎng)液。

6. D12：往培養(yǎng)瓶補加160ml培養(yǎng)基(含因子IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和5%自體血漿)，此時瓶子含320mL 培養(yǎng)液。

7. D14-15 ：收獲目的細胞。

注意事項：請勿吹打細胞，細胞維持抱團生長，如果聚團過大，可輕揉或者拍打培養(yǎng)袋。如果想得到更理想的擴增效果，可使用CD56抗體預包被瓶子。

流式鑒定細胞純度達80%以上