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人外周血NK細胞分離培養(yǎng)視頻教程

發(fā)布時間:2024-08-08 16:42:27 細胞資源庫平臺 訪問量:367

NK細胞介紹

NK細胞(natural killer cell, NK)通常被稱作自然殺傷細胞,無須抗原預先致敏即可直接殺傷某些靶細胞,包括腫瘤細胞、病毒或細菌感染的細胞。

NK細胞是機體重要的天然免疫細胞之一,主要存在于脾臟和外周血中。當感染首次發(fā)生時,NK細胞能主動出擊,殺死被感染的細胞,因此也被稱為“天然殺手”。

人外周血NK細胞分離培養(yǎng)

本實驗室采用獨有的細胞因子培養(yǎng)法,將外周血中的單個核細胞進行誘導,經(jīng)過14天的誘導培養(yǎng),CD3-/CD56+NK細胞絕對數(shù)量可擴增達到1000倍,其純度可達80%以上。

優(yōu)勢

1.無需預包被,操作簡單;

2.擴增效率高;

3.目的細胞百分比高的特點。

實驗前準備

(1)提前開啟紫外線照射超凈臺30min。

(2)紫外照射完畢后,75%酒精消毒超凈臺,超凈臺通風10min以上。

(3)水浴鍋提前開啟,加熱至56攝氏度;

(4)KBM-581培養(yǎng)基、IL-2提前從冰箱取出,放至室溫。

試劑耗材

試劑:人PBMC細胞分離液、清洗液、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、581培養(yǎng)基(圖片)

耗材:10ml移液管,15ml離心管,采血管,T75培養(yǎng)瓶(圖片)

儀器;離心機、CO2培養(yǎng)箱、冰箱、顯微鏡(圖片)

人外周血NK細胞實驗步驟

(一)單個核細胞分離

血液樣本量10mL 時, 實驗方法如下:

第一步:鋪血

1. 取2支 15mL 離心管, 各加入 5mL 分離液(與血液體積相同)。

2. 用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上;

第二步:離心

3.500xg,離心 20min。(分離PBMC時離心轉(zhuǎn)速設(shè)置為慢升慢降,升為9,降調(diào)為0;)

4. 離心后,此時離心管中由上至下分為四層。第一層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個核細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。(分層圖片)

第三步:血漿滅活

5. 收集血漿到新的離心管中;血漿56攝氏度30min滅活,900xg離心10min,取上清,置于-20℃,15min,再次900xg離心10min,取上清,置于4℃保存。

第四步:分離單個核細胞

6. 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個核細胞層到另一50mL離心管中,向所得離心管中加入10mL 清洗液,混勻細胞。

第五步:清洗

7 . 300xg,離心 10min。

8 . 棄上清。

9. 用吸管以 10mL 清洗液重懸所得細胞。

10. 300xg,離心 10min。

11. 重復 7、 8、 9,棄上清后以 0.5mL (根據(jù)實驗需要重懸體積不等)后續(xù)實驗所需相應(yīng)液體重懸細胞。

(二)NK細胞培養(yǎng)

1. D0 :將制備好的單個核細胞(PBMC)重懸,按細胞密度1.0-2.0M cells/mL鋪于T-25瓶中。約用10ml 581培養(yǎng)基,培養(yǎng)基加入因子IL-2 (1000 U/mL)、IL-12(20 ng/mL)、IL-15 (20 ng/mL)、IL-18(100ng/mL)和5%自體血漿。

2. D4 :補加10ml培養(yǎng)基(含IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和5%自體血漿),此時瓶子含20mL培養(yǎng)基。

3. D6: 補加20ml培養(yǎng)基(含IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和5%自體血漿),此時瓶里含有40ml培養(yǎng)基。

4. D8 :往培養(yǎng)瓶補加40ml培養(yǎng)基(含IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和5%自體血漿),同時加入IL-21(50 ng/mL),此時瓶子含80mL 培養(yǎng)液。

5. D10:往培養(yǎng)瓶補加80ml培養(yǎng)基(含因子IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和5%自體血漿),此時瓶子含160mL 培養(yǎng)液。

6. D12:往培養(yǎng)瓶補加160ml培養(yǎng)基(含因子IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和5%自體血漿),此時瓶子含320mL 培養(yǎng)液。

7. D14-15 :收獲目的細胞。

注意事項:請勿吹打細胞,細胞維持抱團生長,如果聚團過大,可輕揉或者拍打培養(yǎng)袋。如果想得到更理想的擴增效果,可使用CD56抗體預包被瓶子。

nk細胞流式鑒定細胞純度達80%以上

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