小鼠肝實質細胞簡介

肝實質細胞(hepatocytes)是肝臟的主要組成和功能細胞。原代肝實質細胞在肝臟疾病的體外模擬、肝病藥物篩選、新藥安全性評估等領域都有不可替代的應用，并在肝細胞移植治療、體外生物人工肝等領域都有眾多潛在的應用價值。但長期以來，原代肝實質細胞都無法體外長期培養(yǎng)，更無法體外擴增，一直是肝臟研究領域的關鍵障礙。

小鼠肝實質細胞分離培養(yǎng)步驟

小鼠肝實質細胞分離培養(yǎng)主要試劑

戊巴比妥、小鼠肝細胞灌注液1 (Perfusion buffer 1) 預熱、小鼠肝細胞灌注液11 (Perfusion buffer 11) 預熱、小鼠肝實質細胞完全培養(yǎng)基、留置針、鑷子及剪刀、注射器、70um細胞篩、預冷離心機、水浴鍋、促貼壁培養(yǎng)基 預冷

小鼠肝實質細胞操作步驟

1. 迅速麻醉小鼠，固定小鼠，75%酒精清理腹部

2. 腹部皮肉分離后剪開肌肉層至胸膈膜，并將內臟小腸等撥至自己右前方，充分暴露門靜脈和下腔，在我們對應的左側皮膚剪開口子用于引流灌流消化液體。

3. 在下腔靜脈處入針，拔出導針有回血后用手固定

4. 灌流灌注液1 (Perfusion buffer 1)，緩慢灌入，可見肝臟充盈，此時剪開門靜脈引流，1-2min內推完10 mL至肝臟內無血液

5. 換上肝細胞灌注液11 (Perfusion buffer 11)，低速灌流，并節(jié)律性擠壓門靜脈切口(擠壓5-10s左右，間隔30s-1min,讓肝臟充盈，提高消化率)，持續(xù)消化5-10min不等，消化肝臟直至用棉簽按壓肝臟有塌陷感或者部分透明感，條紋樣的裂紋

6. 將肝小葉向上撥開，找到門靜脈連接的肝門，用彎鑷鉗住，向前拉，剝離肝臟和膈膜連接后向上提，分離肝臟和內臟組織連接

7. 置入含有10mL預冷培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，轉入超凈工作臺，隨后用鑷子撕裂肝包膜(直接撕裂肝小葉更迅速直接)，消化得當，撕裂后即有細胞掉落，液體變渾濁，用鑷子夾住肝門晃落細胞或者用1mL槍輕輕吹打。

8. 用70um過濾器過濾到含10mL預冷促貼壁培養(yǎng)基的50mL離心管，此后操作注意保持低溫，可提高肝細胞活性。

9. 50g，4℃，1min(第一次離心可設置2min，在1min后按stop)后吸走上清

10. 10mL~20mL(一只小鼠差不多10mL足夠)預冷促貼壁培養(yǎng)基重懸后，計數(shù)和細胞活率，鋪板

11. 12h后可換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24-48h，一般會直接用于實驗

6cm培養(yǎng)皿細胞量2x106cells

10cm培養(yǎng)皿細胞量5-6x106cells

小鼠肝實質細胞鑒定

1.形態(tài)學鑒定

倒置顯微鏡下觀察肝細胞，剛分離的肝實質細胞呈分散狀態(tài)，圓球形，細胞體透亮、細胞核清晰;接種后 6 h，部分肝實質細胞開始貼壁，細胞形狀呈現(xiàn)不規(guī)則狀，有向外延伸趨勢，相鄰的細胞間開始建立連接;培養(yǎng) 72 h，肝實質細胞呈不規(guī)則多角形，相鄰肝細胞彼此連

接更加緊密，形成索狀或島狀結構

2. 標志物檢測

角蛋白 18(CK18)是正常肝實質細胞中高特異性表面抗原，可用來鑒定肝細胞。