原代細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續(xù)生長，同時也將細胞數(shù)量擴大,就必須進行傳代(再培養(yǎng))。傳代培養(yǎng)也是種將細胞種保存下去的方法。同時也利培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經(jīng)消化后才能分瓶。那么原代細胞如何進行傳代培養(yǎng)及在過程中應注意哪些事項?

原代細胞傳代培養(yǎng)的過程

1、組織塊培養(yǎng)物的傳代過程基本操作過程

1) 將原代培養(yǎng)物連同底物蓋玻片一同取出，置于無菌的培養(yǎng)皿上。

2) 用刀將培養(yǎng)物分割，刮去多余的部分，剩余繼續(xù)培養(yǎng)的部分。一般是分割刮去組織塊外圍的部分組織，留下中央的部分組織繼續(xù)培養(yǎng)?；虿糠址指畈⑻羧ソM織塊，留下遷移出來的細胞于底物蓋玻片上繼續(xù)培養(yǎng)。也可以將組織塊挑出，再種植于新的底物蓋玻片上繼續(xù)培養(yǎng)。

3) 給剩余的培養(yǎng)物加上培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

2、分離細胞培養(yǎng)物—貼壁型細胞的傳代過程：有兩項核心工作：一是分割培養(yǎng)物，二是再接種

基本操作過程

1) 取出培養(yǎng)瓶，打開瓶蓋，用吸管吸出舊的培養(yǎng)液。

2) 用無 Ca2+ 、Mg 2+ 的平衡鹽溶液輕輕漂洗培養(yǎng)物1 次到 2 次，洗去殘余血清后棄去平衡鹽溶液。

3) 在培養(yǎng)皿內(nèi)加入胰蛋白酶溶液， 室溫下消化 5min 到 15min 顯微鏡下觀察細胞突起縮回近似圓形、細胞之間的間隙增大時停止消化。

4) 吸管吸去消化液后立即加入含血清培養(yǎng)液或蛋白酶抑制劑，抑制胰蛋白酶的活性，使消化終止。

5) 用彎頭吸管吸取培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液反復吹打瓶皿底壁，使已經(jīng)消化的細胞脫離瓶皿底壁。

6) 低速離心，棄去上清液。

7) 用新鮮培養(yǎng)液將細胞沉淀重新懸浮，計數(shù)并調整細胞密度。

8) 根據(jù)傳代目的將細胞懸浮液接種到一個或多個新的培養(yǎng)器皿中。

3、分離細胞培養(yǎng)物—懸浮型細胞的傳代過程

基本操作過程

1) 將培養(yǎng)物移入離心管低速離心。根據(jù)傳代目的將細胞懸液接種在一個或多個新的培養(yǎng)皿中。

2) 用吸管吸去上清液，加入新鮮培養(yǎng)液使細胞沉淀重新懸浮

3) 根據(jù)傳代目的將細胞懸液接種在一個或多個新的培養(yǎng)皿中。

4) 加足培養(yǎng)液，加蓋封口，加入恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

原代細胞傳代培養(yǎng)的注意事項

1)離體培養(yǎng)的細胞生命力比較脆弱，因此傳代時細胞沒有生長到培養(yǎng)瓶底壁面積的 80%以前，不要急于傳代。

2)首次傳代，由于原代培養(yǎng)中各種類型的細胞?；祀s生長，傳代時不同細胞又不同的消化時間，因而要根據(jù)需要注意及時處理。

3)對貼壁細胞消化后的吹打過程要有序進行，要從一邊開始到另一邊結束，尤其是器皿的四角處， 確保瓶皿底壁各處的細胞都被吹打脫離。 吹打時動作不宜過猛， 吹出液體的力度要適中，否則會直接損傷細胞并產(chǎn)生能傷害細胞的氣泡。

4)對于貼壁能力較弱，容易脫壁的細胞，可以不經(jīng)蛋白酶原消化處理和終止消化這兩步，直接對原代培養(yǎng)物或經(jīng)漂洗后用吸管進行吹打使細胞脫離瓶皿底壁。 這種直接吹大的方法對生命力旺盛的細胞如某些腫瘤細胞較為合適。 高強度機械吹打易對細胞造成傷害較大， 細胞也常有較大數(shù)量的丟失， 因而絕大部分貼壁生長的細胞需消化后才能吹打， 一般不單獨采用高強度機械吹打。

5)首次傳代時適當增大接種的細胞密度，使培養(yǎng)的細胞間盡快發(fā)生相互作用，有利于傳代細胞的存活。

6)傳代數(shù)是指對培養(yǎng)物傳代的次數(shù)，它不等于細胞分裂的次數(shù)或細胞的代數(shù)，而僅代表傳代操作的次數(shù)。

7)傳代對細胞的影響或傷害程度僅次于將活細胞從生物體內(nèi)取出并進行原代培養(yǎng)的程度。只是因為傳代后的細胞生長并不像剛開始原代培養(yǎng)時那樣緩慢罷了。

8)每經(jīng)過一次傳代，細胞的生長環(huán)境就相應發(fā)生一次較大變化。體外生長的細胞若處于動蕩的生活環(huán)境中， 細胞的遺傳特性往往容易發(fā)生改變。 經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)的細胞， 往往容易轉化為惡性細胞。 因此， 傳代對細胞生長和性狀會產(chǎn)生不利影響， 一般情況下要盡可能減少傳代次數(shù)。

無菌操作注意事項

1)操作前要洗手，進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。

2)點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。

3)操作動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。

4)不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。

5)瓶子開口后要盡量保持45"C斜位。

6)吸溶液的吸管等不能混用。