vero非洲綠猴腎細胞背景簡介

Vero細胞由日本學者Yasumura和Kawakita兩人在1962年正式從非洲綠猴腎臟分離，1964年6月15日B. Simizu將其從千葉大學帶到國立健康研究所(NIH)國立過敏及傳染病研究所熱帶病毒實驗室時，已傳至第93代。

ATCC細胞庫vero細胞圖片

逸漠細胞庫vero細胞圖片

vero細胞特點

1)Vero細胞來源方便，明確，易建庫及保存，可連續(xù)傳代，生長速率快

2)Vero細胞遺傳性狀穩(wěn)定，具有良好的生物安全性

3)Vero細胞生產(chǎn)的病毒滴度高，并能較好的依附于片狀載體/微載體，易于在生物反應器中進行放大，因此Vero細胞被越來越多地用于生產(chǎn)病毒類疫苗，并使用生物反應器工藝取代了傳統(tǒng)轉瓶工藝來進行生產(chǎn)。

vero細胞培養(yǎng)實驗準備

提前開啟紫外照射30min消毒滅菌，工作臺開燈通風10min，用75%酒精擦拭臺面。

器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭、濾器、吸管、多孔培養(yǎng)皿、6cm皿、10cm皿，培養(yǎng)瓶等。

試劑：MEM培養(yǎng)液、緩沖液、PBS、消化液、血清、抗生素。

vero細胞培養(yǎng)條件

vero細胞培養(yǎng)基：MEM+10%FBS+1%PS

vero細胞傳代比例：1:2至1:3，每周 2-3次

vero細胞代次如何確定：如果vero細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)

生長條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳;溫度：37℃

凍存條件：無血清凍存液(或者冷凍保存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配)，液氮儲存

消化時間：1-3min(視細胞情況而定)

vero細胞培養(yǎng)注意事項

1.運輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)vero細胞，請按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。

2.vero細胞首次傳代建議1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿，不是1個T25瓶傳2個10cm皿。

vero細胞培養(yǎng)方法

vero細胞復蘇步驟

1.將含有1 mL vero猴腎細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻;

2.在1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻;

3.將所有vero猴腎細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜(或將細胞懸液加入6cm皿中，加入約4 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜);

4.第二天換液并檢查vero細胞密度。

vero細胞傳代步驟

如果vero細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-3 min(視細胞情況而定)，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，加2-3ml完全培養(yǎng)基終止消化。輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心5 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

3.將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

vero細胞凍存方法

待vero細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為例;

1.收集vero細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。

2.根據(jù)vero細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。

3.將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

我們在培養(yǎng)細胞時，通常會出現(xiàn)很多問題，比如細胞狀態(tài)不好，生長緩慢，貼壁細胞不貼壁等問題。 那么這些出現(xiàn)這些問題的原因是什么呢?又有哪些解決辦法呢?

Vero細胞用途

1.vero細胞用于檢查大腸桿菌毒素。大腸桿菌毒素最初就因此細胞系而被命名為Vero毒素，后來被稱為志賀菌素樣毒素，因為它與在痢疾志賀菌中分離出來的志賀菌素很相似。

2.作為培養(yǎng)病毒的細胞宿主。比如：測定某種藥物對病毒復制速度的影響，檢驗是否存在狂犬病毒或者為了研究目的培養(yǎng)病毒。

3.作為真核寄生蟲的宿主細胞，尤其是錐體蟲屬。

4.用于疫苗生產(chǎn)中的病毒培養(yǎng)基質細胞，是在限定代次內(nèi)不致癌的異倍體細胞，WHO批準可以用于人類疫苗的生產(chǎn)基質。

Vero細胞特性

Vero細胞系是連續(xù)的非整倍體細胞 。連續(xù)細胞系可以經(jīng)過許多分裂周期而不衰老。非整倍體是指細胞中的染色體數(shù)目與通常的不同。Vero 細胞有干擾素分泌缺陷的特點;與其它普通哺乳動物細胞不同，當被病毒感染時，它不能分泌干擾素，但它仍然具有α/β-干擾素的受體，所以對于其它來源的干擾素仍有正常的反應。

vero細胞培養(yǎng)常見問題

vero細胞培養(yǎng)出現(xiàn)小黑點，怎么處理?

消化離心棄上清后，PBS重懸洗洗，750rpm低速離心4分鐘，重新鋪下，鋪回去鏡下觀察一下是不是干凈的。

vero細胞生長過慢怎么辦?

原因分析

1.更換不同培養(yǎng)基或血清導致。

解決方法：分析新培養(yǎng)基與原培養(yǎng)基的成分，比較新血清與原血清支持細胞生長實驗，讓細胞逐漸適應新培養(yǎng)基。

2.有少量細菌或真菌污染。

解決方法： 用含抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，盡量丟棄培養(yǎng)物。

3.試劑保存不當導致。

解決方法：血清需要保存在-10到-20℃。培養(yǎng)基需在2-8℃避光保存。含血清完全培養(yǎng)液在2-8℃保存，要在1周內(nèi)用完。

4.接種細胞起始濃度太低。

解決方法：增加接種細胞起始濃度。

5.細胞已老化。

解決方法：引入新的保種細胞，重新培養(yǎng)。

6.支原體污染。

解決方法：吸取部分培養(yǎng)基，離心得上清，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱?？稍谂囵B(yǎng)皿里加入支原體去除劑清除，但如發(fā)現(xiàn)支原體污染，盡量建議丟棄。

vero細胞培養(yǎng)過程中不貼壁怎么樣?

貼壁細胞培養(yǎng)不貼壁原因及解決方法

1.胰酶消化過度導致。

解決方法：縮短胰酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度 。

2.支原體污染 。

解決方法：吸取培養(yǎng)2-3的培養(yǎng)基，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

3.培養(yǎng)基pH值過堿(NaHCO3分解)。

解決方法：使用無菌醋酸溶液調整pH值或充入無菌CO2。

4.細胞老化 。

解決方法：購買新的代數(shù)較低的細胞。

5.接種細胞起始濃度太低或太高。

解決方法：調節(jié)最佳接種細胞濃度。