今天給大家分享的是關于原代人脂肪間充質干細胞提取制備鑒定分離實驗流程，在提取細胞前，需要老師準備相應的人脂肪干細胞專用培養(yǎng)基、專用消化酶、0.25% 胰蛋白酶、PBS、青霉素-鏈霉素等試劑。

人脂肪間充質干細胞提取制備鑒定分離實驗流程

實驗材料

人脂肪主要試劑

人脂肪干細胞專用培養(yǎng)基、專用消化酶、0.25% 胰蛋白酶、PBS、青霉素-鏈霉素

人脂肪間充質干細胞提取操作步驟

(1)將無菌條件下取約5 g腹部皮下脂肪，用含有 500 U/ml 雙抗的 PBS 充分漂洗 3 遍，剔除肉眼可見的血管及結締組織，用眼科剪將其充分剪碎，再用 PBS 反復沖洗，盡量除去紅細胞；

(2)加入 2 倍體積的專用消化酶，振蕩混勻后，于 37 ℃的恒溫水浴箱消化 60 min；

(3)加入等體積的含有 10% FBS 的培養(yǎng)基終止消化；

(4)1 800 r/min 離心 10 min(離心后分為 3 層，上層為油脂及未消化完全的脂肪組織，中層為上清液，下層為脂肪干細胞和紅細胞等混合細胞的沉淀)；

(5)棄上層和中層，加入 2 ml 專用培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，70 μm 細胞篩網過濾，將濾過后的濾液調整細胞濃度為 1×108/L 接種至 60 mm 細胞培養(yǎng)皿中，于 37 ℃ 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(6)將提取的原代 ADSCs培養(yǎng) 24 h 后進行半量換液，48 h 后進行全量換液，去除殘存的紅細胞、細胞碎片等。之后每 2 d換液 1 次。

人脂肪間充質干細胞傳代

獲得純化后的 ADSCs，培養(yǎng) 7~9 d 后，原代 ADSCs 可生長融合達到 90%，用 0.25%胰蛋白酶(含有 0.2% EDTA)常規(guī)消化后，1∶3 傳代接種到新的細胞培養(yǎng)皿中持續(xù)體外擴增培養(yǎng)。

人脂肪間充質干細胞形態(tài)及鑒定

人脂肪干細胞呈梭形、漩渦狀生長

1.細胞表面標記：CD44, CD73，CD90，CD105

2.成脂，成骨分化能力