80%;皮下原位瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移率較低),高轉(zhuǎn)移亞系:篩選方法:通過反復(fù)體內(nèi)傳代篩選出高侵襲亞系,肺轉(zhuǎn)移能力提升至60%">

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B16F10-FLuc小鼠黑色素瘤細(xì)胞成瘤驗(yàn)證介紹

發(fā)布時間:2025-04-21 09:46:32 細(xì)胞資源庫平臺 訪問量:103

黑色素瘤是一種由黑色素細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化形成的高度侵襲性皮膚腫瘤,其發(fā)病率逐年上升且易早期轉(zhuǎn)移,晚期患者因耐藥性和免疫逃逸機(jī)制導(dǎo)致生存率顯著降低。構(gòu)建黑色素瘤成瘤模型(如體外細(xì)胞系、基因工程小鼠模型、患者來源異種移植模型及類器官等)對揭示其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制至關(guān)重要,這類模型可模擬腫瘤微環(huán)境異質(zhì)性、轉(zhuǎn)移特性和藥物反應(yīng)差異,為靶向治療篩選、免疫療法優(yōu)化及耐藥機(jī)制研究提供可控平臺。其科學(xué)價值不僅在于加速抗腫瘤藥物研發(fā)進(jìn)程,更能通過個性化模型推動精準(zhǔn)醫(yī)療,為臨床轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

細(xì)胞簡介

細(xì)胞名稱:B16F10-FLuc-puro小鼠黑色素瘤(FLUC標(biāo)記)

種屬來源:小鼠

組織來源:皮膚

生長特性:貼壁生長

細(xì)胞形態(tài):上皮細(xì)胞樣混有梭形細(xì)胞

背景介紹:Luciferase B16F10細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)螢火蟲熒光素酶。該細(xì)胞株性狀穩(wěn)定,培養(yǎng)時不需要添加抗生素維持??捎米魑灮鹣x熒光素酶活性檢測中的陽性對照,也可用于活體動物成像實(shí)驗(yàn)。該細(xì)胞通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶Luc基因。其親本株是來源于小鼠皮膚黑色素瘤細(xì)胞B16的亞克隆株之一,從C57BL/6J 品系小鼠的皮膚黑色素瘤組織中分離而來。

puro藥篩濃度:B16F10-FLuc-puro細(xì)胞puro藥篩濃度為1.0ug/ml,培養(yǎng)過程中建議使用0.5ug/ml puro維持

培養(yǎng)須知:首次復(fù)蘇或長期未用嘌呤霉素時,建議用含嘌呤霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)24-48小時以清除非抗性細(xì)胞。建議定期備份低代次細(xì)胞,并記錄熒光素酶活性數(shù)據(jù)以確保實(shí)驗(yàn)一致性。如有特殊需求(如無血清培養(yǎng)),需逐步馴化并驗(yàn)證基因穩(wěn)定性。雙標(biāo)記(FLuc+Puro)確保長期基因穩(wěn)定性,但需持續(xù)篩選壓力。

B16F10-NLuc-puro細(xì)胞在小鼠體內(nèi)成瘤案例(僅供參考)

細(xì)胞系基因修飾常用模型成瘤潛伏期(天)成瘤率轉(zhuǎn)移性成像兼容性
B16F10-FLuc-puroFLUC+puro抗性肺轉(zhuǎn)移、皮下荷瘤5-7>95%高(肺轉(zhuǎn)移>80%)高(活體生物發(fā)光成像)
B16F10-Luc1FLUC(無抗性篩選)肺轉(zhuǎn)移、皮下荷瘤5-7~90%高(肺轉(zhuǎn)移>70%)中高(信號衰減較快)
A375-FLuc-PuroFLUC+puro抗性免疫缺陷鼠皮下荷瘤14-21~70%低(需基因增強(qiáng)轉(zhuǎn)移)中(需免疫缺陷鼠)
A2058-LucFLUC(無抗性篩選)免疫缺陷鼠轉(zhuǎn)移模型10-14~80%中(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)

中(背景噪音較高)

B16F10 小鼠成瘤模型特點(diǎn)總結(jié)

1. 成瘤時間:皮下接種后約5-7天可見明顯腫瘤(接種量5×10? cells/只)。

2. 成瘤率:接近100%(免疫健全小鼠)。

3. 轉(zhuǎn)移傾向:高轉(zhuǎn)移性(靜脈注射后肺轉(zhuǎn)移率>80%;皮下原位瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移率較低)。

4. 高轉(zhuǎn)移亞系:篩選方法:通過反復(fù)體內(nèi)傳代篩選出高侵襲亞系,肺轉(zhuǎn)移能力提升至60%。

5. 適用模型:肺轉(zhuǎn)移模型、皮下荷瘤模型、原位黑色素瘤模型

6. 成像兼容性:表達(dá)FLuc的B16F10細(xì)胞可用于活體生物發(fā)光成像(BLI)監(jiān)測腫瘤生長和轉(zhuǎn)移

同類基因修飾黑色素瘤細(xì)胞系在小鼠體內(nèi)成瘤情況(僅供參考)

產(chǎn)品貨號細(xì)胞系成瘤率物種來源轉(zhuǎn)移傾向應(yīng)用場景
IM-M002B16F10+++小鼠(C57BL/6)高(肺轉(zhuǎn)移>80%)活體成像監(jiān)測、轉(zhuǎn)移機(jī)制研究、免疫治療評估
-B16F1+++小鼠(C57BL/6)低(肺轉(zhuǎn)移<20%)

原位腫瘤模型、局部藥物遞送研究、腫瘤微環(huán)境分析

IM-H332A375++人(皮膚原發(fā))低(需基因增強(qiáng)轉(zhuǎn)移)靶向治療(BRAF/MEK抑制劑)、人源腫瘤異種移植(PDX模型)
IM-H440A2058++人(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)中(淋巴結(jié)傾向性轉(zhuǎn)移)

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)制、化療耐藥性研究、臨床前藥物篩選(免疫缺陷鼠)

IM-H243MeWo+人(皮膚轉(zhuǎn)移)中(自發(fā)肺/肝轉(zhuǎn)移)轉(zhuǎn)移微環(huán)境模擬、EMT(上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化)研究、耐藥性模型
IM-H463SK-MEL-28++人(皮膚原發(fā))低(局部侵襲為主)免疫檢查點(diǎn)抑制劑測試、非BRAF突變型黑色素瘤

B16F10-NLuc-puro細(xì)胞成瘤影響因素及優(yōu)化策略

類別具體因素影響說明
細(xì)胞因素

1. 細(xì)胞活力與狀態(tài)(傳代次數(shù)、凍存/復(fù)蘇操作)

2. 熒光素酶表達(dá)穩(wěn)定性

3. 支原體污染

低活力或熒光素酶表達(dá)衰減會導(dǎo)致成瘤失敗;支原體污染抑制細(xì)胞增殖。
宿主因素

1. 小鼠品系(C57BL/6 vs. 免疫缺陷鼠)

2. 年齡與免疫狀態(tài)

3. 飼養(yǎng)環(huán)境(溫度、應(yīng)激水平)

C57BL/6小鼠因免疫排斥可能抑制成瘤;老齡或免疫異常小鼠模型穩(wěn)定性差。
操作因素

1. 接種部位(皮下、尾靜脈、原位)

2. 接種細(xì)胞數(shù)量與體積

3. 是否使用基質(zhì)膠(Matrigel)

皮下接種易操作但轉(zhuǎn)移率低;尾靜脈需高細(xì)胞活性;基質(zhì)膠可增強(qiáng)局部成瘤率。
檢測因素

1. 熒光素酶底物(D-熒光素)濃度與注射時間

2. 成像設(shè)備靈敏度

3. 麻醉劑對生物發(fā)光的影響

底物劑量不足或成像延遲導(dǎo)致信號弱;部分麻醉劑(如異氟烷)可能抑制熒光素酶活性。
優(yōu)化方向具體因素影響說明

細(xì)胞處理

1. 嚴(yán)格質(zhì)量控制:復(fù)蘇后檢測細(xì)胞活力(>90%)、熒光素酶活性及支原體污染。

2. 避免高傳代(建議<15代),定期驗(yàn)證熒光素酶表達(dá)(如活體成像或裂解液檢測)。

高傳代導(dǎo)致基因不穩(wěn)定,熒光素酶表達(dá)可能丟失(Puromycin抗性需持續(xù)加壓維持)。

宿主選擇

1. 免疫缺陷小鼠(如NOD/SCID或NSG)用于高成瘤率研究。

2. C57BL/6小鼠需年輕(6-8周)、健康,接種前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

免疫缺陷鼠缺乏T/B細(xì)胞,減少對同源B16F10細(xì)胞的排斥反應(yīng)。
接種優(yōu)化

1. 皮下接種:細(xì)胞數(shù)1×10^6~5×10^6/只,混合50% Matrigel(4℃預(yù)冷操作)。

2. 尾靜脈接種:細(xì)胞數(shù)2×10^5~1×10^6/只,懸浮于PBS(避免結(jié)團(tuán))

Matrigel提供基質(zhì)支持,模擬微環(huán)境;尾靜脈需單細(xì)胞懸液防止肺栓塞。
成像檢測

1. 底物注射:D-熒光素150 mg/kg(腹腔注射),10-15分鐘后成像。

2. 使用低抑制性麻醉劑(如異氟烷),避免苯巴比妥類。3. 校準(zhǔn)設(shè)備參數(shù)(曝光時間、分辨率)。

D-熒光素代謝快,需控制時間窗;異氟烷對熒光素酶活性影響較小(文獻(xiàn)支持)。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計

1. 設(shè)置空白對照組(未標(biāo)記細(xì)胞)排除背景信號。

2. 分批接種避免操作誤差,每組≥5只小鼠。

3. 長期實(shí)驗(yàn)時定期傳代驗(yàn)證細(xì)胞特性。

減少個體差異;確保模型可重復(fù)性。

常見問題與解決方案

問題原因解決方案
成瘤率低(<50%)

細(xì)胞活性不足、免疫排斥、接種細(xì)胞數(shù)過低

提高細(xì)胞數(shù)至5×10^6/只,使用免疫缺陷鼠,或聯(lián)合免疫抑制劑(如抗CD4抗體)
熒光信號衰減熒光素酶基因沉默、底物失效、成像參數(shù)錯誤Puromycin加壓維持表達(dá),更換底物批次,重新優(yōu)化成像條件
轉(zhuǎn)移模型不顯著尾靜脈接種細(xì)胞結(jié)團(tuán)、小鼠品系抗轉(zhuǎn)移性強(qiáng)

過濾細(xì)胞懸液(40 μm濾網(wǎng)),改用高轉(zhuǎn)移性亞系(如B16F10-Luc2-Bioware)

B16F10-NLuc-puro細(xì)胞成瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)實(shí)例

研究目的 實(shí)驗(yàn)設(shè)計

評估免疫療法療效

將B16F10接種于C57BL/6小鼠,分組給予PD-1抗體或?qū)φ眨O(jiān)測腫瘤體積及生存期

研究肺轉(zhuǎn)移機(jī)制尾靜脈注射B16F10細(xì)胞,通過活體成像定量肺轉(zhuǎn)移灶,分析轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)譜。
測試靶向藥物耐藥性

構(gòu)建B16F10耐藥株,聯(lián)合PI3K抑制劑處理,評估凋亡率及信號通路變化。

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