免疫熒光(immunofluorescence technic)Coons等于1941年首次采用熒光素進行標記而獲得成功。這種以熒光物質(zhì)標記抗體而進行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù)(fluorescentantibodytechnique)?！∮脽晒饪贵w示蹤或檢查相應抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)，因為熒光色素不但能與抗體球蛋白結(jié)合，用于檢測或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，用于檢測或定位抗體，但是在實際工作中熒光抗原技術(shù)很少應用，所以人們習慣稱為熒光抗體技術(shù)，或稱為免疫熒光技術(shù)。以熒光抗體方法較常用。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細胞(或組織)化學技術(shù)。

細胞免疫熒光原理

免疫學的基本反應是抗原-抗體反應。由于抗原抗體反應具有高度的特異性，所以當抗原抗體發(fā)生反應時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體(或抗原)上，與其相應的抗原(或抗體)結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應。

直接法

將標記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標本上，經(jīng)一定的溫度和時間的染色，用水洗去未參加反應的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。

間接法

如檢查未知抗原，先用已知未標記的特異抗體(第一抗體)與抗原標本進行反應，用水洗去未反應的抗體，再用標記的抗抗體(第二抗體)與抗原標本反應，使之形成抗體—抗原—抗體復合物，再用水洗去未反應的標記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。標記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對雞的球蛋白發(fā)生反應，因此，制備標記抗體適用于任何抗原的診斷。

細胞免疫熒光實驗步驟

細胞免役熒光準備實驗材料

1.抗體：根據(jù)需要使用的抗體，可以選擇合適的抗體。

2.細胞：根據(jù)實驗需要，選擇合適的細胞進行實驗，并在37℃5%C02的培養(yǎng)箱條件下保持培養(yǎng)，直到實驗需要。

3.用于洗滌細胞的生理鹽水或PBS緩沖液：使用無菌的生理鹽水或PBS緩沖液洗滌細胞，可以保護細胞免受外界環(huán)境影響。

4.收集細胞：如酶標記或其他標記，獲得細胞膜豐度，收集細胞進行數(shù)目統(tǒng)計，以確定最終實驗細胞數(shù)量。

5.熒光染料：根據(jù)需要，選擇合適的熒光染料，按指定的比例混合，配制成熒光染料溶液備用。

細胞免役熒光固定和滲透化處理

1.使用適當?shù)木彌_液(如甲醛)或有機溶劑(如甲醇)將細胞/組織進行固定處理。

2.在室溫或低溫下，將緩沖液中的固定液置于載玻片或孔板中，進行固定處理。

3.固定后，用洗滌緩沖液(如PBS)洗滌細胞/組織，去除多余的固定液。

4.在細胞內(nèi)透明化的同時，保持細胞結(jié)構(gòu)完整。

細胞免役熒光抗體染色

1.準備合適的一抗和二抗。一抗是特異性與待檢測蛋白結(jié)合的抗體，二抗是帶有熒光染料的抗體。

2.將一抗稀釋到適當?shù)臐舛龋⒓尤氲捷d玻片或孔板中，與細胞孵育。

3.將載玻片或孔板中的一抗與細胞孵育30-60分鐘，使抗體與待檢測的蛋白相結(jié)合。

4.在恰當?shù)南礈炀彌_液中洗滌載玻片或孔板，去除多余的一抗。

5.同樣的方法，添加二抗到載玻片或孔板中，并孵育30-60分鐘，使二抗與一抗結(jié)合。

6.再次使用洗滌緩沖液洗滌載玻片或孔板，去除多余的二抗。

細胞免役熒光顯微鏡觀察

1.利用適當?shù)娘@微鏡鏡頭，觀察載玻片或孔板上的細胞，并選取合適的區(qū)域進行觀察。

2.使用適當?shù)臒晒鉃V波片，觀察細胞中的熒光信號。

3.根據(jù)實驗設(shè)計的需要，進行圖像記錄和分析。

細胞免疫熒光實驗是一種常見的實驗技術(shù)，可以用于研究細胞中的蛋白質(zhì)表達和定位，提供有關(guān)蛋

白質(zhì)在細胞內(nèi)的空間分布和功能的信息。不同的實驗目的和需求可能會有一些細微的差異，因此可以根

據(jù)具體的實驗目的進行相應的調(diào)整或優(yōu)化步驟。

細胞免役熒光技術(shù)應用

檢測靶蛋白如內(nèi)分泌激素、蛋白質(zhì)、多肽、核酸、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、細胞因子、細胞表面抗原、腫瘤標志物。

細胞免役熒光常見問題

1.怎樣選擇二抗標記的熒光

A: 二抗標記的熒光顏色的選擇非常重要，要求在實驗前根據(jù)現(xiàn)有材料和儀器的局限性設(shè)計好實驗方案，一般我們進行三種顏色的標記工作。目前細胞核染料常用PI(紅色)或DAPI(藍色)，如果細胞中還表達EGFP(綠色)，則需要選用其他顏色的熒光素來標記目的蛋白，不得已的情況下采用顏色相近，后期也要用光譜拆分技術(shù)對圖片進行處理(需專業(yè)人員進行，不建議采用相近顏色)。

2.怎樣選擇細胞免疫化學爬片所用的固定劑?

用甲醇，強烈脫水變性蛋白，并可溶解脂類物質(zhì)產(chǎn)生通透效應;蛋白變性完全，對抗原的保存性好，能充分暴露出抗原，無需通透處理不易保存細胞形態(tài)，細胞可能呈扁平狀。

細胞結(jié)構(gòu)抗原、酶類抗原交聯(lián)劑用多聚甲醛，導致細胞內(nèi)分子相互連接呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并維持在原位上，更易于保持細胞的結(jié)構(gòu)交聯(lián)產(chǎn)生的阻礙可能會降低細胞組分的抗原性，需要通透處理細胞膜相關(guān)組分蛋白。

3.做細胞免疫熒光大概提供多少抗體合適?

A：細胞免疫熒光實驗我們需先進行預實驗采用普通熒光顯微鏡進行觀察，確認實驗條件后再進行Confocal拍攝的正式實驗。確認實驗條件后再進行Confocal拍攝的正式實驗。24孔板的細胞爬片在進行一抗37℃孵育時，一般加入200ul經(jīng)BSA稀釋的一抗，其稀釋倍數(shù)需參考抗體說明書，如稀釋倍數(shù)為1：100則每張爬片需要2ul(進行細胞免疫熒光的一抗稀釋倍數(shù)要比WB的小)。注意提供的抗體量需滿足預實驗和正式實驗所需的量。

4.激光共聚膠顯微鏡拍攝除用于細胞免疫熒光拍攝外還可以進行哪些檢測?

A：由于各種熒光標記探針的應用，通過對熒光探針分布和熒光強度的分析，Confocal實驗還可以用于進行細胞內(nèi)游離鈣、線粒體膜電位、活性氧、細胞膜流動性、細胞結(jié)構(gòu)等實驗結(jié)果的拍攝和分析工作。根據(jù)客戶對細胞處理的要求并且購買合適的探針試劑盒，我們也可以為您進行您實驗所需的Confocal拍攝工作。