熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)是一種基于熒光素酶催化底物氧化反應(yīng)產(chǎn)生生物發(fā)光的檢測(cè)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)研究。其中，螢火蟲(chóng)熒光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高靈敏度、寬線性檢測(cè)范圍(約7~8個(gè)數(shù)量級(jí))以及較短的半衰期(在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中約為3小時(shí)，在植物細(xì)胞中約為3.5小時(shí))而成為最常用的報(bào)告基因。其發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度在酶濃度為10?1? mol/L至10?? mol/L的范圍內(nèi)與酶活性呈線性關(guān)系，并且在理想條件下可檢測(cè)到低至10?2? mol/L的熒光素酶活性。此外，熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)具有非放射性、檢測(cè)快速、靈敏度高(比氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT高100倍)等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于高通量篩選和活細(xì)胞檢測(cè)。通過(guò)將熒光素酶報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞后，可利用熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)靈敏且便捷地監(jiān)測(cè)基因表達(dá)水平，已成為細(xì)胞生物學(xué)研究中的重要工具。

基本信息

英文標(biāo)題：Assessment of α-Fetoprotein Targeted HSV1-tk Expression in Hepatocellular Carcinoma with In Vivo Imaging

中文標(biāo)題：甲胎蛋白靶向HSV1-tk在肝細(xì)胞癌中的體內(nèi)成像評(píng)估及治療效應(yīng)研究

發(fā)表期刊：《Cancer Biother. Radiopharm》

影響因子：2.4

作者單位：

1.Korea Institute of Radiological and Medical Sciences

2.Dankook University

作者信息：

Ju Hui Park, Kwang II Kim, Kyo Chul Lee

研究背景

肝細(xì)胞癌(HCC)的早期診斷和治療仍面臨挑戰(zhàn)，甲胎蛋白(AFP)作為HCC的血清標(biāo)志物，在胎兒期后表達(dá)沉默，但在肝癌中重新激活。研究利用AFP特異性增強(qiáng)子/啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV1-tk)基因表達(dá)，結(jié)合放射性核素成像技術(shù)(如18F-FHBG PET)和代謝成像(18F-FDG PET)，旨在實(shí)現(xiàn)AFP陽(yáng)性肝癌的靶向基因治療和實(shí)時(shí)療效監(jiān)測(cè)，提升治療特異性并減少對(duì)正常組織的毒性。

研究方法

本研究通過(guò)構(gòu)建受AFP增強(qiáng)子/啟動(dòng)子調(diào)控的HSV1-tk重組腺病毒(AdAFP-TK)，驗(yàn)證其體外和體內(nèi)的靶向表達(dá)及治療效果。首先，通過(guò)分子克隆技術(shù)將HSV1-tk基因插入AFP調(diào)控序列下游，構(gòu)建AdAFP-TK，并在293細(xì)胞中擴(kuò)增和純化。體外實(shí)驗(yàn)中，采用RT-PCR和125I標(biāo)記的IVDU(5-碘乙烯基-2'-脫氧尿苷)攝取實(shí)驗(yàn)，評(píng)估AFP陽(yáng)性肝癌細(xì)胞(HuH-7、HepG2)與陰性細(xì)胞(HT-29、SK-Hep-1)中HSV1-tk的表達(dá)特異性;通過(guò)MTT法檢測(cè)不同濃度GCV(0-100 μM)對(duì)感染AdAFP-TK的細(xì)胞存活率影響。動(dòng)物模型中，Balb/c-nu/nu小鼠皮下接種HuH-7或HepG2腫瘤后，瘤內(nèi)注射AdAFP-TK與AdAFP-fLuc(熒光素酶基因)混合液，利用生物發(fā)光成像(BLI)和18F-FHBG PET分別監(jiān)測(cè)熒光素酶和HSV1-tk的靶向表達(dá)。治療組小鼠接受GCV(50 mg/kg)連續(xù)5天腹腔注射，通過(guò)腫瘤體積測(cè)量和18F-FDG PET動(dòng)態(tài)評(píng)估代謝變化以驗(yàn)證療效。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1：體外驗(yàn)證AFP靶向HSV1-tk表達(dá)

通過(guò)RT-PCR和放射性核苷類似物攝取實(shí)驗(yàn)，明確AdAFP-TK的靶向性。RT-PCR結(jié)果顯示，僅在AFP陽(yáng)性細(xì)胞(HuH-7、HepG2)中檢測(cè)到HSV1-tk mRNA，而AFP陰性細(xì)胞(HT-29、SK-Hep-1)無(wú)表達(dá)。125I-IVDU攝取實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示，AdAFP-TK感染的HuH-7和HepG2細(xì)胞在MOI=50時(shí)，放射性攝取分別達(dá)53倍和161倍于陰性對(duì)照組(HT-29)，且與病毒劑量呈正相關(guān)。這一結(jié)果證實(shí)了AFP增強(qiáng)子/啟動(dòng)子對(duì)HSV1-tk表達(dá)的嚴(yán)格調(diào)控，為后續(xù)體內(nèi)靶向性奠定基礎(chǔ)。

圖2：GCV介導(dǎo)的細(xì)胞毒性分析

MTT實(shí)驗(yàn)表明，AdAFP-TK聯(lián)合GCV對(duì)AFP陽(yáng)性細(xì)胞具有選擇性殺傷作用。在GCV濃度為100 μM時(shí)，HuH-7細(xì)胞存活率降至20%以下(MOI=10)，而AFP陰性細(xì)胞(HT-29、SK-Hep-1)存活率仍高于80%。相比之下，CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的AdCMV-TK對(duì)所有細(xì)胞均表現(xiàn)出廣譜毒性，與AFP調(diào)控組的靶向性形成鮮明對(duì)比。該實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了AFP靶向系統(tǒng)的安全性，避免對(duì)正常組織的脫靶效應(yīng)。

圖3：體內(nèi)AFP靶向基因表達(dá)的分子成像

混合注射AdAFP-TK和AdAFP-fLuc后，BLI和18F-FHBG PET同步顯示AFP陽(yáng)性腫瘤的基因表達(dá)。BLI顯示熒光信號(hào)集中于HuH-7和HepG2瘤體，而18F-FHBG PET定量分析表明，注射病毒的腫瘤放射性攝取顯著高于肌肉(SUVmax達(dá)5.27)，未注射病毒組僅1.16。這一多模態(tài)成像策略不僅驗(yàn)證了AFP調(diào)控系統(tǒng)的靶向效率，還證明了HSV1-tk作為治療-成像雙功能基因的潛力。

圖4：GCV治療的體內(nèi)療效評(píng)估

GCV治療后，AdAFP-TK組的HuH-7腫瘤體積增長(zhǎng)顯著抑制(第7天體積較對(duì)照組減少50%)，而18F-FDG PET顯示治療組SUVmax逐漸下降，對(duì)照組持續(xù)上升。代謝變化早于形態(tài)學(xué)改變，表明18F-FDG PET可早期反映治療響應(yīng)。該結(jié)果凸顯了分子影像在療效動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)中的優(yōu)勢(shì)，為臨床轉(zhuǎn)化提供了重要依據(jù)。

研究結(jié)論

AdAFP-TK在AFP陽(yáng)性肝癌細(xì)胞(HuH-7、HepG2)中特異性激活HSV1-tk表達(dá)，體外實(shí)驗(yàn)顯示GCV(100 μM)可顯著抑制AFP陽(yáng)性細(xì)胞存活率(p<0.05)，而陰性細(xì)胞未受影響。體內(nèi)分子成像證實(shí)，AFP調(diào)控的熒光素酶和HSV1-tk表達(dá)分別通過(guò)BLI和18F-FHBG PET可視化，腫瘤/肌肉放射性比值達(dá)3.46-5.27。GCV治療顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)(第4天起差異顯著，p<0.05)，18F-FDG PET顯示治療組代謝活性持續(xù)下降，對(duì)照組則升高。該研究首次實(shí)現(xiàn)AFP靶向基因治療與多模態(tài)成像(BLI/PET)的同步驗(yàn)證，為肝癌的精準(zhǔn)治療和療效實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)提供了新策略。