基本信息

英文標(biāo)題：SOX4 facilitates brown fat development and maintenance through EBF2-mediated thermogenic gene program in mice

中文標(biāo)題：SOX4通過EBF2介導(dǎo)的產(chǎn)熱基因程序促進(jìn)小鼠棕色脂肪的發(fā)育和維持

發(fā)表期刊：《Cell death and differentiation》

影響因子：13.7

作者單位：

細(xì)胞應(yīng)激生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)創(chuàng)新中心，教育部分子診斷工程研究中心

廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院廈門心血管病研究所心臟電生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院健康與醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)科學(xué)國家研究所

中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院

作者信息：

Shuai Wang;Ting He;Ya Luo;Kexin Ren;Huanming Shen;Lingfeng Hou;Yixin Wei;Tong Fu;Wenlong Xie;Peng Wang;Jie Hu;Yu Zhu;Zhengrong Huang;Qiyuan Li;Weihua Li;Huiling Guo;Boan Li

研究背景

棕色脂肪的研究

大量研究表明，代謝活躍的棕色脂肪存在于嬰兒和成人中，并且人類BAT活動的增加與體重下降相關(guān)。因此，促進(jìn)BAT的發(fā)展和功能可能是對抗肥胖及相關(guān)代謝紊亂的一種有前途的策略。

棕色脂肪的調(diào)控因子

幾種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子已被證明參與了BAT的發(fā)展和功能。先前的譜系研究表明，經(jīng)典的棕色脂肪細(xì)胞來源于在胚胎發(fā)育過程中表達(dá)En1、Pax3、Pax7和Myf5的多能祖細(xì)胞。在BAT發(fā)育過程中，這些祖細(xì)胞發(fā)展為前脂肪細(xì)胞，隨后通過轉(zhuǎn)錄級聯(lián)分化為棕色脂肪細(xì)胞。早期B細(xì)胞因子2(EBF2)是棕色脂肪細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。它能夠招募過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPARγ)，這是一種在脂肪細(xì)胞分化過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，到其棕色特異性結(jié)合位點(diǎn)，以維持BAT身份。去除對EBF2的抑制作用可以增強(qiáng)白色脂肪細(xì)胞的產(chǎn)熱潛力。最近的研究表明，EBF2增強(qiáng)了ERRα/PGC1α復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄活性，以促進(jìn)產(chǎn)熱基因的表達(dá)并維持BAT的核心溫度。這些發(fā)現(xiàn)表明EBF2對于棕色脂肪細(xì)胞分化和產(chǎn)熱功能至關(guān)重要。然而，EBF2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子仍然未知。

SOX4的作用

SRY相關(guān)高遷移率組盒轉(zhuǎn)錄因子4(SOX4)是Sox C家族的一員，包含高遷移率組DNA結(jié)合域(HMG-Box域)和C端轉(zhuǎn)錄激活域(TAD域)。它在調(diào)節(jié)細(xì)胞干性、細(xì)胞分化以及神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌島和心臟的發(fā)育中起關(guān)鍵作用。我們發(fā)現(xiàn)SOX4不僅抑制WAT中的前脂肪細(xì)胞決定，而且在長期寒冷暴露期間作為PPARγ的共激活因子促進(jìn)米色脂肪細(xì)胞的形成。

SOX4與棕色脂肪

盡管棕色和米色脂肪分化的調(diào)控涉及一組重疊的泛脂肪生成和BAT特異性轉(zhuǎn)錄在現(xiàn)有研究中，SOX4在決定棕色脂肪細(xì)胞命運(yùn)中的潛在作用尚不明確。我們發(fā)現(xiàn)，SOX4通過促進(jìn)Ebf2的轉(zhuǎn)錄，對小鼠的褐色脂肪組織發(fā)育和產(chǎn)熱功能至關(guān)重要，這一過程可能受到PKA激活的促進(jìn)。

研究意義

我們的研究揭示了SOX4在調(diào)控產(chǎn)熱基因程序中的調(diào)節(jié)作用和機(jī)制，并表明靶向SOX4可能是對抗肥胖以提高能量消耗的一種潛在策略。

研究方法

實(shí)驗(yàn)動物與飼養(yǎng)條件

小鼠種類為C57BL/6遺傳背景的雄性，在22–24°C溫度、50–60%濕度、12小時(shí)光照/黑暗周期下群居籠中飼養(yǎng)。

飲食條件

小鼠分別接受含67.4%碳水化合物、20.6%蛋白質(zhì)、12%脂肪的普通飲食，或含20%碳水化合物、20%蛋白質(zhì)、60%脂肪的高脂飲食。

免疫組化和免疫熒光

使用HE染色、免疫熒光和免疫組化技術(shù)對小鼠組織進(jìn)行染色和觀察，以研究特定蛋白的表達(dá)和定位。

透射電子顯微鏡

通過透射電子顯微鏡技術(shù)觀察小鼠BAT組織的超微結(jié)構(gòu)。

身體成分分析

使用Echo MRI組成分析儀評估小鼠的脂肪和瘦肉質(zhì)量。

紅外熱成像和耐寒測試(CTT)

通過紅外熱成像和耐寒測試來評估小鼠的體溫調(diào)節(jié)能力。

基因表達(dá)分析

使用定量PCR和RNA-Seq技術(shù)分析小鼠組織中基因的表達(dá)水平。

細(xì)胞培養(yǎng)與脂肪細(xì)胞分化

在體外培養(yǎng)小鼠BAT前脂肪細(xì)胞，并通過特定培養(yǎng)基誘導(dǎo)其分化為成熟的棕色脂肪細(xì)胞。

油紅O染色和甘油三酯測量

通過油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成，并測量甘油三酯水平以評估脂肪細(xì)胞的脂肪積累。

棕色脂肪細(xì)胞氧消耗率(OCR)測定

使用XF96 Extracellular Flux Analyzer測定分化后的棕色脂肪細(xì)胞的氧消耗率，以評估其代謝活性。

腺病毒的構(gòu)建、純化和注射

構(gòu)建并純化攜帶Sox4基因的腺病毒，并將其注射到小鼠BAT中以實(shí)現(xiàn)SOX4的過表達(dá)。

腺相關(guān)病毒(AAV)的包裝和純化

構(gòu)建并純化攜帶SOX4基因的腺相關(guān)病毒，通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)以實(shí)現(xiàn)SOX4的過表達(dá)。

熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞和測定熒光素酶活性來研究基因啟動子的活性。

染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)和ChIP測序分析

通過ChIP技術(shù)結(jié)合高通量測序分析SOX4蛋白在基因組中的結(jié)合位點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Sox4-MKO小鼠構(gòu)建：通過Myf5-Cre小鼠與Sox4f/f小鼠交配，特異性地在BAT中敲除Sox4基因。

SOX4蛋白水平降低：Sox4-MKO小鼠的BAT、iWAT和gWAT中SOX4蛋白水平顯著降低。

BAT形態(tài)學(xué)改變：Sox4-MKO小鼠的BAT組織形態(tài)發(fā)生改變，脂滴大小顯著減小。

胚胎BAT發(fā)育異常：E15.5 Sox4-MKO胚胎的肩胛間BAT區(qū)域發(fā)育異常，SOX4和UCP1表達(dá)降低。

ob/ob小鼠BAT變化：ob/ob小鼠BAT中SOX4和UCP1蛋白及mRNA水平均降低。

飲食影響B(tài)AT：高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠BAT中SOX4和UCP1表達(dá)降低。

年齡影響B(tài)AT：隨著年齡增長，小鼠BAT中SOX4和UCP1表達(dá)降低。

Sox4-MKO新生鼠產(chǎn)熱不足：Sox4-MKO新生鼠在冷暴露下皮膚溫度降低，表明產(chǎn)熱能力受損。

Sox4-MKO成鼠體溫調(diào)節(jié)受損：Sox4-MKO成鼠在冷暴露后核心體溫下降，血糖和血清游離脂肪酸水平升高，BAT中甘油三酯含量降低。

Sox4-MKO成鼠能量代謝降低：Sox4-MKO成鼠在冷暴露下氧消耗和熱量產(chǎn)生降低，對β3-腎上腺素能受體激動劑的反應(yīng)減弱。

Sox4-BKO新生鼠產(chǎn)熱不足：Sox4-BKO新生鼠在冷暴露下皮膚溫度降低，表明產(chǎn)熱能力受損。

Sox4-BKO成鼠體溫調(diào)節(jié)受損：Sox4-BKO成鼠在冷暴露后核心體溫下降，血糖和血清游離脂肪酸水平升高，BAT中甘油三酯含量降低。

Sox4-BKO成鼠能量代謝降低：Sox4-BKO成鼠在冷暴露下氧消耗和熱量產(chǎn)生降低。

Sox4-MKO小鼠對高脂飲食更易感：Sox4-MKO小鼠在高脂飲食喂養(yǎng)下體重增加更多，顯示出對肥胖的易感性。

葡萄糖耐量受損：Sox4-MKO小鼠在葡萄糖耐量測試中血糖水平更高，表明葡萄糖代謝受損。

胰島素耐量受損：Sox4-MKO小鼠在胰島素耐量測試中血糖水平更高，表明胰島素敏感性降低。

脂肪質(zhì)量和分布改變：Sox4-MKO小鼠的脂肪質(zhì)量和瘦肉質(zhì)量比例改變，BAT、iWAT、gWAT和肝臟的重量與體重比例增加。

脂肪組織形態(tài)學(xué)改變：Sox4-MKO小鼠的脂肪組織顯示脂滴增大，炎癥標(biāo)記物F4/80表達(dá)增加。

代謝活動降低：Sox4-MKO小鼠的食物攝入量、運(yùn)動活動、氧消耗和產(chǎn)熱均降低，表明整體代謝活動下降。

Sox4-MKO小鼠BAT超微結(jié)構(gòu)改變：透射電子顯微鏡顯示Sox4-MKO小鼠的BAT中線粒體數(shù)量減少，脂滴增大。

線粒體蛋白表達(dá)降低：免疫熒光和qPCR分析顯示Sox4-MKO小鼠BAT中TOM20和線粒體DNA的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)降低。

RNA測序揭示基因表達(dá)變化：RNA測序和熱圖分析顯示Sox4-MKO小鼠BAT中大量基因表達(dá)下調(diào)，包括線粒體功能和脂肪代謝相關(guān)基因。

線粒體功能基因表達(dá)降低：RT-PCR分析顯示Sox4-MKO小鼠BAT中線粒體復(fù)合物基因表達(dá)降低。

BAT特異性基因表達(dá)降低：RT-PCR分析顯示Sox4-MKO小鼠BAT中多個(gè)BAT特異性基因表達(dá)降低。

蛋白水平降低：Western blot分析顯示Sox4-MKO小鼠BAT中SOX4、線粒體呼吸鏈成分、BAT特異性蛋白和AGT蛋白的表達(dá)降低。

Sox4在棕色脂肪細(xì)胞分化中的必要性：通過慢病毒介導(dǎo)的shRNA技術(shù)，在體外抑制Sox4表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Sox4對于棕色脂肪細(xì)胞的分化是必需的。

Sox4缺失影響脂肪積累：Sox4缺失導(dǎo)致分化后的棕色脂肪細(xì)胞中脂滴減少，甘油三酯含量降低。

BAT特異性基因表達(dá)降低：Sox4缺失導(dǎo)致棕色脂肪細(xì)胞中BAT特異性基因的mRNA水平顯著降低。

WAT特異性基因表達(dá)增加：Sox4缺失導(dǎo)致棕色脂肪細(xì)胞中WAT特異性基因的mRNA水平增加。

蛋白水平降低：Sox4缺失導(dǎo)致棕色脂肪細(xì)胞中BAT富集蛋白和AGT蛋白的表達(dá)降低。

線粒體數(shù)量減少：Sox4缺失導(dǎo)致棕色脂肪細(xì)胞中線粒體DNA的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)降低。

氧消耗率降低：Sox4缺失導(dǎo)致棕色脂肪細(xì)胞的氧消耗率降低，表明其代謝活性下降。

RNA測序與基因本體分析：RNA測序數(shù)據(jù)顯示Sox4-MKO和Ebf2-AKO BAT中重疊下調(diào)基因，基因本體分析揭示與BAT發(fā)育相關(guān)基因顯著下調(diào)。

ChIP測序結(jié)果：ChIP測序顯示SOX4在Ebf2啟動子上游-4k處顯著富集結(jié)合，表明直接調(diào)控關(guān)系。

ChIP分析：ChIP分析證實(shí)SOX4蛋白在BAT SVF中Ebf2啟動子上游-4k處有顯著占用。

螢光素酶活性實(shí)驗(yàn)：NIH3T3細(xì)胞中，SOX4轉(zhuǎn)染顯著增強(qiáng)野生型pGL4.26-EBF2載體的螢光素酶活性，突變載體無此效應(yīng)。

Ebf2啟動子轉(zhuǎn)錄活性：NIH3T3細(xì)胞中，SOX4顯著提高Ebf2啟動子的相對轉(zhuǎn)錄活性，ΔHMG和ΔTAD突變體活性降低。

FAIRE實(shí)驗(yàn)：BAT SVF細(xì)胞感染shSOX4慢病毒后，Ebf2啟動子區(qū)域的染色質(zhì)開放性降低。

免疫熒光分析：E15.5 Sox4f/f和Sox4-MKO胚胎中，Sox4-MKO胚胎的EBF2表達(dá)顯著降低。

UMAP圖：E10.5到E13.5小鼠胚胎間充質(zhì)和骨骼肌細(xì)胞的UMAP圖顯示BAT發(fā)育區(qū)域的細(xì)胞簇。

發(fā)育階段細(xì)胞突出顯示：UMAP圖中根據(jù)發(fā)育階段起源突出顯示細(xì)胞。

Sox4和Ebf2表達(dá)模式：不同細(xì)胞簇中Sox4和Ebf2的表達(dá)模式顯示其相關(guān)性。

平均表達(dá)水平：E10.5到E13.5小鼠胚胎中Ebf2和Sox4的平均表達(dá)水平顯示其協(xié)同變化。

人類iPSCs分化表達(dá)：人類iPSCs分化為棕色脂肪細(xì)胞過程中，Sox4和Ebf2的mRNA表達(dá)水平同步變化。

免疫染色實(shí)驗(yàn)：BAT SVF細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中處理1小時(shí)后，免疫染色顯示SOX4的核定位變化。

ChIP-Seq分析：對照組和3X HA-SOX4表達(dá)的BAT SVF細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中處理，ChIP-Seq分析顯示SOX4在Ebf2啟動子上的結(jié)合模式及新發(fā)基序。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)：BAT SVF細(xì)胞經(jīng)不同處理(DMSO、佛司可林、H89)后，佛司可林刺激顯示SOX4蛋白核轉(zhuǎn)位增強(qiáng)。

ChIP-qPCR：未處理或佛司可林處理的BAT SVF中，SOX4在Ebf2啟動子上的占有率顯著增加。

RT-qPCR分析：Sox4-MKO和對照小鼠的BAT SVF細(xì)胞經(jīng)佛司可林處理后，Ebf2 mRNA水平顯著變化。

冷暴露實(shí)驗(yàn)：Sox4f/f和Sox4-MKO小鼠在冷暴露后，BAT中Ebf2的表達(dá)水平顯著不同。

螢火蟲報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：不同處理的BAT SVF細(xì)胞中，Ebf2增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄活性顯著變化。

質(zhì)譜分析：HEK293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-PRKACA或KD-PRKACA與HA-SOX4，質(zhì)譜分析顯示SOX4磷酸化位點(diǎn)。

氨基酸殘基比對：不同物種SOX4殘基S325及其相鄰氨基酸殘基的比對。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)：NIH3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)染Flag-SOX4(WT或S235A突變體)，佛司可林處理后SOX4核轉(zhuǎn)位變化。

qPCR分析：NIH3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)染Flag-SOX4(WT或S235A突變體)，佛司可林處理后Ebf2 mRNA水平變化。

機(jī)制圖解：佛司可林誘導(dǎo)PKA激活，SOX4在S235處磷酸化，核轉(zhuǎn)位后與EBF2合作激活EBF2轉(zhuǎn)錄。

免疫熒光分析：SOX4和EBF2在成熟BAT脂肪細(xì)胞核中共定位，提示功能相互作用。

免疫沉淀和Western blot分析：抗SOX4抗體免疫沉淀驗(yàn)證了SOX4與EBF2的物理結(jié)合。

ChIP實(shí)驗(yàn)：SOX4在Ucp1和Prdm16基因啟動子區(qū)域顯著占有率，表明直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

FAIRE實(shí)驗(yàn)：Sox4-BKO小鼠在Ucp1和Prdm16啟動子上游區(qū)域的DNA富集減少，影響染色質(zhì)開放狀態(tài)。

轉(zhuǎn)錄活性評估：SOX4和EBF2共同過表達(dá)顯著增強(qiáng)Ucp1和Prdm16啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。

示意圖模型：冷刺激或福司可林激活PKA，磷酸化SOX4促進(jìn)核定位，與EBF2協(xié)同增強(qiáng)產(chǎn)熱基因轉(zhuǎn)錄。

研究結(jié)論

1. SOX4對BAT發(fā)育和產(chǎn)熱的重要性

SOX4是BAT發(fā)育和產(chǎn)熱程序的必需因子。

Sox4-MKO和Sox4-BKO小鼠在冷暴露時(shí)出現(xiàn)BAT變白和體溫過低。

2. Sox4-MKO小鼠的產(chǎn)熱能力降低

Sox4-MKO小鼠產(chǎn)熱能力下降，易受飲食誘導(dǎo)的肥胖影響。

3. SOX4過表達(dá)增強(qiáng)產(chǎn)熱

BAT中過表達(dá)SOX4可增強(qiáng)產(chǎn)熱，對抗飲食誘導(dǎo)的肥胖。

4. SOX4通過激活EBF2轉(zhuǎn)錄調(diào)控棕色脂肪命運(yùn)

SOX4通過激活EBF2的轉(zhuǎn)錄決定棕色脂肪細(xì)胞的命運(yùn)。

5. PKA磷酸化SOX4促進(jìn)核內(nèi)轉(zhuǎn)移和EBF2轉(zhuǎn)錄

PKA在S235位點(diǎn)磷酸化SOX4，促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位和EBF2的轉(zhuǎn)錄。

6. SOX4與EBF2合作激活產(chǎn)熱基因轉(zhuǎn)錄程序

SOX4與EBF2共同激活調(diào)控產(chǎn)熱基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄程序。