熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)是一種基于熒光素酶催化底物氧化反應(yīng)產(chǎn)生生物發(fā)光的檢測(cè)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)研究。其中，螢火蟲(chóng)熒光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高靈敏度、寬線性檢測(cè)范圍(約7~8個(gè)數(shù)量級(jí))以及較短的半衰期(在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中約為3小時(shí)，在植物細(xì)胞中約為3.5小時(shí))而成為最常用的報(bào)告基因。其發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度在酶濃度為10?1? mol/L至10?? mol/L的范圍內(nèi)與酶活性呈線性關(guān)系，并且在理想條件下可檢測(cè)到低至10?2? mol/L的熒光素酶活性。此外，熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)具有非放射性、檢測(cè)快速、靈敏度高(比氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT高100倍)等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于高通量篩選和活細(xì)胞檢測(cè)。通過(guò)將熒光素酶報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞后，可利用熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)靈敏且便捷地監(jiān)測(cè)基因表達(dá)水平，已成為細(xì)胞生物學(xué)研究中的重要工具。

基本信息

英文標(biāo)題：Development of luciferase-based highly sensitive reporters that detect ER-associated protein biogenesis abnormalities

中文標(biāo)題：基于螢火蟲(chóng)熒光素酶的高靈敏度報(bào)告基因的開(kāi)發(fā)，用于檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白質(zhì)生物合成異常

發(fā)表期刊：《iScience》

影響因子：4.6

作者單位：

1.Advanced Materials, Tohoku University, Sendai, Miyagi 980-8577, Japan

2.Institute for Research Initiatives, Nara Institute of Science and Technology, Ikoma, Nara 630-0192, Japan

3.Cell Biology Center, Institute of Integrated Research, Institute of Science Tokyo, Yokohama, Kanagawa 226-8501, Japan

作者信息：

Hiroshi Kadokura, Nanshi Harada, Satoshi Yamaki

研究背景

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是分泌途徑蛋白質(zhì)生物合成的關(guān)鍵場(chǎng)所，其定位和二硫鍵形成對(duì)蛋白質(zhì)功能至關(guān)重要?，F(xiàn)有檢測(cè)ER蛋白質(zhì)異常的方法(如基于GFP的熒光探針)存在靈敏度低、光毒性強(qiáng)、數(shù)據(jù)波動(dòng)大等問(wèn)題。本文受細(xì)菌MalF-LacZ報(bào)告系統(tǒng)的啟發(fā)，通過(guò)工程化改造螢火蟲(chóng)熒光素酶(FLuc)，開(kāi)發(fā)了一種高靈敏度、高重復(fù)性的報(bào)告系統(tǒng)，用于檢測(cè)ER中蛋白質(zhì)定位缺陷和二硫鍵形成異常。

研究方法

本研究通過(guò)工程化改造螢火蟲(chóng)熒光素酶(FLuc)，引入多個(gè)半胱氨酸突變(如V61C、L115C等)，使其在ER氧化環(huán)境中因二硫鍵錯(cuò)誤折疊而失活;當(dāng)ER發(fā)生定位缺陷或二硫鍵形成異常時(shí)，F(xiàn)Luc恢復(fù)活性。通過(guò)優(yōu)化信號(hào)肽(如calreticulin的N端40個(gè)氨基酸)增強(qiáng)ER定位效率，并添加N-糖基化位點(diǎn)和FLAG標(biāo)簽用于檢測(cè)。采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)(以海腎熒光素酶RLuc為內(nèi)參)減少實(shí)驗(yàn)誤差。通過(guò)siRNA敲低SRP54(信號(hào)識(shí)別顆粒關(guān)鍵組分)、小分子抑制劑CADA處理(靶向CD4信號(hào)序列)以及BPA(Ero1α抑制劑)和LMF1過(guò)表達(dá)/敲低實(shí)驗(yàn)，分別驗(yàn)證了報(bào)告系統(tǒng)對(duì)ER定位缺陷、藥物誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制以及ER氧化還原動(dòng)態(tài)的檢測(cè)能力。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1：工程化改造螢火蟲(chóng)熒光素酶以檢測(cè)ER中的二硫鍵形成缺陷

研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)在螢火蟲(chóng)熒光素酶(FLuc)中引入8個(gè)半胱氨酸突變(如V61C、L115C等)，使其在ER的氧化環(huán)境中因異常二硫鍵形成而失活。

實(shí)驗(yàn)顯示，正常條件下ER定位的FLuc活性顯著降低(圖1F)，但用還原劑DTT處理細(xì)胞后，二硫鍵被破壞，F(xiàn)Luc活性恢復(fù)(圖1G)，表明突變成功賦予FLuc對(duì)ER氧化狀態(tài)的敏感性。此外，通過(guò)對(duì)比野生型FLuc與突變體的活性(圖1E)，發(fā)現(xiàn)部分半胱氨酸替換不影響酶活性，為后續(xù)設(shè)計(jì)奠定了基礎(chǔ)。

該結(jié)果表明，工程化的FLuc可作為檢測(cè)ER二硫鍵形成缺陷的靈敏報(bào)告基因。

圖2：優(yōu)化信號(hào)肽設(shè)計(jì)增強(qiáng)ER定位并提高報(bào)告基因靈敏度

通過(guò)延長(zhǎng)信號(hào)肽(從calreticulin的17個(gè)氨基酸擴(kuò)展至40個(gè)氨基酸)，并引入雙N-糖基化位點(diǎn)，顯著提高了FLuc*(突變體)的ER定位效率(圖2C)。

原始設(shè)計(jì)(Calr(17 aa)-FLuc*)因部分蛋白滯留胞質(zhì)導(dǎo)致背景活性較高，而優(yōu)化后的Calr(40 aa)-FLuc幾乎完全定位于ER(圖2C)。

DTT處理后，Calr(40 aa)-FLuc活性提升更顯著(圖2E)，表明信號(hào)肽優(yōu)化減少了胞質(zhì)“泄漏”，增強(qiáng)了對(duì)ER氧化缺陷的檢測(cè)靈敏度。

這一改進(jìn)為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了高信噪比的報(bào)告系統(tǒng)。

圖3：SRP54敲低誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)ER定位缺陷檢測(cè)

通過(guò)siRNA敲低信號(hào)識(shí)別顆粒(SRP)關(guān)鍵組分SRP54，驗(yàn)證報(bào)告系統(tǒng)對(duì)ER定位缺陷的檢測(cè)能力。

SRP54敲低導(dǎo)致IL6R(40 aa)-FLuc部分未能進(jìn)入ER(非糖基化形式累積，圖3C)，F(xiàn)Luc活性顯著升高(圖3D)。

而共表達(dá)siRNA抗性SRP54可回補(bǔ)缺陷(圖3E)，證明活性升高源于SRP依賴性ER定位受損，而非脫靶效應(yīng)。該實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)Luc報(bào)告系統(tǒng)能靈敏反映蛋白質(zhì)靶向ER的異常，適用于研究分泌途徑的調(diào)控機(jī)制。

圖4：基于CD4信號(hào)序列的報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)病毒受體抑制劑CADA

將HIV受體CD4的信號(hào)序列(40個(gè)氨基酸)與FLuc融合，驗(yàn)證小分子抑制劑CADA對(duì)ER定位的特異性抑制。CADA處理導(dǎo)致CD4(40 aa)-FLuc活性顯著升高(圖4D)，并伴隨非糖基化蛋白累積(圖4E)，而對(duì)照信號(hào)序列(bPRL)無(wú)此現(xiàn)象(圖4F)。此結(jié)果證明，F(xiàn)Luc*系統(tǒng)可定制化用于檢測(cè)特定信號(hào)序列的功能異常，為高通量篩選靶向ER定位的抑制劑(如抗病毒藥物)提供了新方法。

圖5：Ero1α活性調(diào)控ER氧化還原環(huán)境的動(dòng)態(tài)檢測(cè)

通過(guò)抑制Ero1α(使用BPA)或過(guò)表達(dá)其超活性突變體(C104A/C131A)，研究ER氧化還原狀態(tài)變化。BPA處理劑量依賴性升高FLuc活性(圖5B)，而超活性Ero1α進(jìn)一步降低活性(圖5D)，表明Ero1α是調(diào)控ER氧化能力的關(guān)鍵因子。通過(guò)Mal-PEG烷基化實(shí)驗(yàn)(圖5C)，直接觀察到BPA處理導(dǎo)致FLuc二硫鍵減少(還原態(tài)比例增加)。此外，減少FLuc的半胱氨酸數(shù)目(Calr(40 aa)-FLuc(-2 Cys))可擴(kuò)大檢測(cè)范圍，區(qū)分Ero1α野生型與突變體的氧化能力差異(圖5G)。這些結(jié)果揭示了ER氧化系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡及報(bào)告系統(tǒng)的靈活性。

圖6：LMF1通過(guò)調(diào)控還原當(dāng)量供應(yīng)影響ER氧化還原穩(wěn)態(tài)

LMF1(脂酶成熟因子1)過(guò)表達(dá)顯著升高FLuc活性(圖6B)，而敲低LMF1則降低活性(圖6C)，表明LMF1通過(guò)向ER提供還原當(dāng)量維持其還原環(huán)境。Western blot顯示，LMF1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致FLuc二硫鍵減少(圖6D)，且不影響其ER定位(圖6E)。此結(jié)果首次在非應(yīng)激條件下證實(shí)LMF1對(duì)ER氧化還原穩(wěn)態(tài)的直接調(diào)控，支持其通過(guò)跨膜電子傳遞參與蛋白質(zhì)折疊的模型，并凸顯FLuc*系統(tǒng)在揭示復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的高靈敏性。

研究結(jié)論

本研究成功開(kāi)發(fā)了基于FLuc的高靈敏度報(bào)告系統(tǒng)，可實(shí)時(shí)檢測(cè)ER中蛋白質(zhì)定位和二硫鍵形成異常，其靈敏度和重復(fù)性顯著優(yōu)于傳統(tǒng)熒光探針。該系統(tǒng)不僅能識(shí)別病毒受體合成抑制劑(如CADA)誘導(dǎo)的定位缺陷，為藥物篩選提供新工具，還揭示了LMF1通過(guò)調(diào)控ER氧化還原穩(wěn)態(tài)(提供還原當(dāng)量)影響蛋白質(zhì)折疊的分子機(jī)制。通過(guò)調(diào)整FLuc*的半胱氨酸數(shù)量，可定制報(bào)告系統(tǒng)以檢測(cè)ER氧化或還原狀態(tài)的變化，為研究分泌蛋白生物合成機(jī)制及疾病相關(guān)靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)提供了重要技術(shù)平臺(tái)。