同源異體小鼠腫瘤模型是免疫腫瘤學(I/O)研究中不可或缺的臨床前模型，但它們對免疫檢查點抑制劑(ICIs)的反應(yīng)有限，這可能是由于它們的固有低免疫原性。為了解決這一問題，研究人員通過將雞卵清蛋白(OVA)這一高度免疫原性的蛋白質(zhì)表達到同源異體腫瘤細胞中，開發(fā)了新的免疫原性同源異體模型。這些模型，如DC2.4-OVA和B16-OVA，顯示出比它們的親本細胞系更慢的腫瘤生長速度，這可能是由于免疫介導的排斥反應(yīng)。更重要的是，這些OVA表達的模型對ICIs，特別是抗PD-1治療，表現(xiàn)出更高的敏感性，這表明它們在增強T細胞介導的免疫反應(yīng)方面具有潛力。此外，通過過繼T細胞轉(zhuǎn)移實驗，研究人員驗證了這些模型中存在腫瘤特異性記憶T細胞。這些結(jié)果表明，OVA工具細胞不僅增強了對ICIs的反應(yīng)，而且為臨床前免疫治療評估提供了新的、具有更高免疫原性的同源異體模型，這對于I/O研究具有重要的意義。

基本信息

英文標題：Monomeric annexin A2 is an oxygen-regulated toll-like receptor 2 ligand and adjuvant

中文標題：單體Annexin A2是一種氧調(diào)節(jié)的Toll樣受體2配體及佐劑

發(fā)表期刊：《Journal for ImmunoTherapy of Cancer》

影響因子：10.3

作者單位：

1. Department of Neurology, New York-Presbyterian/Weill Cornell Medical Center, 525 East 68th St, room F-610, New York, NY 10065, USA

2. Department of Neurosurgery, Hospital Number 1 of China Medical University, Shenyang, China

3. Department of Pathology, University of Southern California, Los Angeles, CA, USA

作者信息：

Brian M. Andersen, Junzhe Xia, Alan L. Epstein

研究背景

Annexin A2(ANXA2)是一類廣泛表達的鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，可通過形成單體(ANXA2m)或與S100A10結(jié)合形成異源四聚體(ANXA2t)發(fā)揮不同功能。既往研究表明，ANXA2t通過TLR4/MyD88通路激活巨噬細胞分泌促炎因子(如IL-6、TNF-α)，但其單體形式的免疫調(diào)節(jié)功能尚未明確。本研究聚焦于腫瘤微環(huán)境中的低氧條件(5% O?)，發(fā)現(xiàn)小鼠膠質(zhì)瘤細胞(GL261)在低氧條件下顯著上調(diào)ANXA2m的表達，而在常氧(20% O?)下幾乎不表達。進一步實驗表明，ANXA2m通過結(jié)合Toll樣受體2(TLR2)激活樹突狀細胞(DC)，增強抗原呈遞能力，提示其可能作為危險相關(guān)分子模式(DAMP)參與腫瘤免疫調(diào)控。這一發(fā)現(xiàn)不僅拓展了ANXA2的功能認知，還為開發(fā)基于ANXA2m的腫瘤疫苗佐劑提供了理論依據(jù)，尤其是在低氧微環(huán)境豐富的實體瘤(如膠質(zhì)母細胞瘤)中具有潛在應(yīng)用價值。

研究方法

研究通過系統(tǒng)性實驗驗證ANXA2m的免疫調(diào)節(jié)機制：首先，將小鼠GL261膠質(zhì)瘤細胞分別置于5%低氧和20%常氧條件下培養(yǎng)，利用質(zhì)譜分析和免疫印跡技術(shù)篩選差異表達蛋白，鑒定出ANXA2m在低氧條件下顯著上調(diào)。隨后，通過免疫共沉淀(Co-IP)和HEK-Blue TLR2/TLR4報告細胞系實驗，證實ANXA2m直接結(jié)合TLR2并激活下游信號通路(如NF-κB)，而四聚體ANXA2t僅通過TLR4發(fā)揮作用。為評估ANXA2m對抗原呈遞細胞的影響，研究從小鼠骨髓中分離培養(yǎng)樹突狀細胞(BMDC)，并檢測ANXA2m處理后共刺激分子(CD80/CD86)及細胞因子(IL-12p70、TNF-α)的表達變化;同時，通過OVA抗原脈沖實驗結(jié)合流式細胞術(shù)(采用25-D1.16抗體檢測SIINFEKL/H-2Kb復(fù)合物)驗證其交叉呈遞能力。體內(nèi)實驗中，TLR2+/+和TLR2?/?小鼠分別接種ANXA2m與OVA混合疫苗，通過多肽-多聚體染色和流式分析量化外周血中抗原特異性CD8+ T細胞頻率，明確TLR2依賴性。此外，研究合成了包含ANXA2 N端36個氨基酸的融合肽(ANXA2-OVA)及其突變體(如缺失前15個氨基酸的ANXA2ΔN15-OVA)，在HEK-Blue TLR2報告細胞和小鼠模型中驗證其TLR2結(jié)合及佐劑活性，揭示關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域。

實驗結(jié)果

圖1：ANXA2m在低氧條件下通過TLR2激活免疫信號

圖 1a 顯示，低氧(5% O?)培養(yǎng)的GL261細胞裂解物通過TLR2依賴性途徑顯著增強抗原特異性CD8+ T細胞的IFN-γ分泌，而常氧(20% O?)裂解物無此效應(yīng)。

圖 1b 通過免疫印跡證實低氧誘導ANXA2高表達，并通過Co-IP驗證ANXA2與TLR2的直接結(jié)合。圖 1c-e進一步利用HEK-Blue TLR2報告細胞系證明，僅ANXA2m(而非ANXA2t)激活TLR2信號，且熱變性或蛋白酶處理破壞其活性，排除脂質(zhì)污染可能。圖 1f通過TLR4?/?小鼠模型，證實ANXA2m的佐劑功能獨立于TLR4。這些數(shù)據(jù)共同表明，ANXA2m是低氧微環(huán)境特異性表達的TLR2配體，具有明確的免疫激活功能。

圖2：ANXA2m增強DC成熟及抗原特異性T細胞應(yīng)答

圖 2a-b 顯示，添加ANXA2m可顯著提升DC對OVA抗原的交叉呈遞能力(SIINFEKL/H-2Kb復(fù)合物表達增加)，且該效應(yīng)僅在TLR2+/+小鼠中顯現(xiàn)。圖 2c-d 通過BMDC實驗證明，ANXA2m誘導CD80/CD86高表達，并促進IL-12p70和TNF-α分泌，提示其促進DC向Th1型免疫極化。圖 2e 在體內(nèi)模型中，ANXA2m-OVA疫苗使TLR2+/+小鼠的外周抗原特異性CD8+ T細胞頻率提升3倍，而TLR2?/?小鼠無響應(yīng)。圖 2f 進一步在人源DC中驗證，ANXA2m可增強CMV pp65抗原特異性T細胞的IFN-γ分泌，且僅見于CMV血清陽性個體。這些結(jié)果從鼠類到人類模型均證實ANXA2m的跨物種佐劑活性。

圖3：ANXA2的N端15個氨基酸是其TLR2結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域

圖 3a 通過TLR2報告細胞實驗表明，僅含ANXA2 N端36個氨基酸的肽段(ANXA2-OVA)可激活TLR2信號，而缺失前15個氨基酸的肽段(ANXA2ΔN15-OVA)或序列打亂的對照肽均無活性。圖 3b 在體內(nèi)免疫模型中，ANXA2-OVA肽疫苗顯著誘導抗原特異性CD8+ T細胞擴增，而ANXA2ΔN15-OVA與對照組無差異。這一發(fā)現(xiàn)不僅定位了ANXA2m的功能結(jié)構(gòu)域，還為設(shè)計短肽佐劑(如30個氨基酸的抗原-ANXA2融合肽)提供了直接依據(jù)，兼具高效性與臨床轉(zhuǎn)化可行性。

研究結(jié)論

本研究首次闡明單體ANXA2(ANXA2m)作為低氧微環(huán)境特異性免疫佐劑的分子機制：ANXA2m通過直接結(jié)合TLR2(非TLR4)激活樹突狀細胞，上調(diào)共刺激分子CD80/CD86的表達，并誘導IL-12p70、TNF-α和IFN-γ分泌，顯著增強抗原交叉呈遞及CD8+ T細胞應(yīng)答。關(guān)鍵功能域分析表明，ANXA2的N端15個氨基酸是TLR2結(jié)合的核心區(qū)域，合成的N端肽段(ANXA2-OVA)可完全模擬全蛋白功能，而截斷該區(qū)域(ANXA2ΔN15-OVA)則喪失活性。這一發(fā)現(xiàn)為開發(fā)新型腫瘤疫苗提供了理論依據(jù)：ANXA2m或其N端短肽(如30個氨基酸的抗原融合肽)可作為高效佐劑，與腫瘤特異性抗原(如新抗原)結(jié)合，設(shè)計“通用型”或個性化疫苗;聯(lián)合其他TLR激動劑(如TLR4配體)可能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，尤其適用于膠質(zhì)瘤等低氧實體瘤的免疫治療。研究不僅拓展了ANXA2的生物學功能認知，還為臨床轉(zhuǎn)化提供了兼具靶向性與可行性的策略。