原代人口腔黏膜上皮細胞背景簡介

人表皮角質形成細胞分離自皮膚組織;表皮位于動物皮膚的外層，由胚胎時期外胚層形成，具有抗摩擦和抗損傷的作用。表皮是皮膚的淺層結構，由復層扁平上皮構成。從基底層到表面可分為五層，即基底層、棘層、顆粒層、透明層和角質層。表皮角質形成細胞是一種能合成角質蛋白的上皮細胞，此類細胞為表皮的主體，由表皮深層始逐漸增殖、分化，并在成為角化的角質細胞中，細胞核與細胞器完全消失，細胞亦失去生理功能而脫落。未脫落部分對機體尚有保護作用，故不必在洗擦身體時用力搓擦，使其過早脫失。表皮角質形成細胞主要分布于表皮基底層，在上皮程序性死亡后，細胞產(chǎn)生角化并移向表皮。體外培養(yǎng)的表皮角化細胞容易導致終末分化，不能充分增殖。角質形成細胞最終產(chǎn)生角質蛋白，在其向角質細胞演變過程中，一般可以分為四層，即基底層、棘層、顆粒層以及角質層。有人把前三層或前二層稱為生發(fā)層或馬爾匹基層。此外，在某些部位，特別在掌跖部位，角質層下方還可見到透明層。

皮膚不但是人體的生理屏障，而且在機體免疫和內分泌等方面起著極其重要的作用。 角質形成細胞是表皮細胞的主要組成部分，角質形成細胞的體外培養(yǎng)可為皮膚毒理學、燒傷治療學、美容學和皮膚病發(fā)病機制的研究提供新的途徑。 但是，皮膚角質形成細胞分離培養(yǎng)中存在細胞易分化、易受成纖維細胞污染、不易貼壁等問題，因此，建立一種操作簡便、細胞活性優(yōu)良的人角質形成細胞分離培養(yǎng)方法具有重要的意義。

人口腔黏膜上皮細胞分離培養(yǎng)方法

人口腔黏膜上皮細胞分離培養(yǎng)主要試劑與儀器

角質細胞專用培養(yǎng)基，角質細胞組織消化液I，角質細胞組織消化液II，胎牛血清，DMSO，雙抗，慶大霉素，T25細胞培養(yǎng)瓶，細胞培養(yǎng)箱，超凈工作臺，低速離心機，手術刀片，尖頭鑷等

人口腔黏膜上皮細胞分離培養(yǎng)操作過程

1. 獲取要求組織寬度大于3mm。在手術室中將組織置于預冷至4℃、含0.5%雙抗的無菌PBS緩沖液中，保證組織完全浸沒

2. 用含0.5%雙抗的PBS緩沖液反復沖洗組織塊10~15遍直至組織塊表面無肉眼可見的污物。用眼科剪仔細剪凈組織塊的黏膜下組織，只留黏膜層，要求盡量平整，不剪碎、剪破組織塊

3. 再次用含0.5%雙抗的PBS緩沖液沖洗處理后的組織塊，并用眼科剪剪成約5mm×5mm的小塊，完全浸入角質細胞組織消化液I的中，將1.5ml離心管用錫紙包裹緊密以避光，置于4℃冰箱中消化18~20h。

酶消化法

1. 次日，采用酶消化法處理組織塊。將1.5ml EP管取出，于超凈臺中打開，用含0.5%雙抗的PBS緩沖液反復沖洗。可觀察到皮膚上皮層呈現(xiàn)淡黃色，用眼科鑷輕輕撕下上皮層，反復沖洗至清亮透明

2. 置于加入了角質細胞組織消化液II的培養(yǎng)皿中，用眼科剪輕柔地將上皮盡量剪碎，防止破壞培養(yǎng)皿底部導致污染。完全剪碎后，將培養(yǎng)皿蓋好并用封口膜封住，置于細胞培養(yǎng)箱中消化15min，每隔5min取出至超凈臺中反復吹打混勻。

3. 15min后，加入1ml胎牛血清終止消化，將細胞懸液轉移至15ml離心管中，1000r/min離心5min

4. 吸出上清液并將細胞沉淀輕輕重懸于1 ml角質細胞專用培養(yǎng)基中，計數(shù)

5. 以 5 x 104 /cm2的密度接種預先包被明膠的培養(yǎng)皿中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)

6. 初始接種后24小時更換培養(yǎng)基以去除未附著的細胞，并每天更換培養(yǎng)基，直到細胞達到所需的匯合度。

人口腔黏膜上皮細胞鑒定

1.形態(tài)學鑒定

角質形成細胞剛接種時呈球形，折光性強，輪廓清晰，24h可見部分細胞貼壁并形成集落，貼壁細胞呈多角形，胞漿透亮，胞核較大，內含1-2個核仁。5d后集落周圍出現(xiàn)淡色衛(wèi)星樣細胞增殖，胞漿豐富，均勻透亮;細胞長滿單層后，呈現(xiàn)典型的鋪路石狀，細胞呈多角形，細胞之間出現(xiàn)“拉網(wǎng)”現(xiàn)象。10d后細胞大部融合成片。

2.標志物檢測

Cytokeratin-18(CK18)是基底層角質形成細胞的陽性標記物。鏡下可見培養(yǎng)細胞cK18免疫熒光染色顯示為陽性，證實培養(yǎng)細胞為基底層角質形成細胞。