人外周血CD8+T細(xì)胞背景介紹

CD8+T-αβ細(xì)胞發(fā)育始于胸腺的淋巴祖細(xì)胞，在胸腺細(xì)胞變成單陽(yáng)性(SP)CD8+或CD4+胸腺細(xì)胞(圖2)[2]之前，淋巴祖細(xì)胞先后經(jīng)歷雙陰性(DN)(CD8– CD4–)階段和雙陽(yáng)性(DP)階段(CD8+ CD4+)。關(guān)于CD8+T細(xì)胞如何形成特異性，DP細(xì)胞通過(guò)與肽：MHC I類復(fù)合物的相互作用在胸腺皮質(zhì)中進(jìn)行陽(yáng)性選擇，生成CD8+SP細(xì)胞。隨后這些SP細(xì)胞從皮質(zhì)遷移到髓質(zhì)，然后將在髓質(zhì)中進(jìn)行陰性克隆選擇，以去除與自身抗原高親和力結(jié)合的T細(xì)胞。最后，成熟單陽(yáng)性CD8+T-αβ細(xì)胞被釋放到循環(huán)中。

人外周血CD8+T細(xì)胞分離,培養(yǎng)步驟

人外周血CD8+T細(xì)胞分離培養(yǎng)主要試劑

人外周血淋巴細(xì)胞分離液，人外周血淋巴細(xì)胞清洗液，rhIL-2，IFN-γ，581培養(yǎng)基，CD8+T分選磁珠，MS分選柱，Multi Stand磁力架

人外周血CD8+T細(xì)胞分離,培養(yǎng)操作過(guò)程

1.細(xì)胞分離

(1) 抽取健康供者外周血10 mL，將血標(biāo)本緩慢加入兩個(gè)盛有5 mL外周血淋巴細(xì)胞分離液的15 mL無(wú)菌離心管中，保持界面清晰。

(2) 400g，30-40 min。

(3) 離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。第一層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴 細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。

(4) 取白環(huán)層，加入 3 倍體積的清洗液混勻，60-100 g，離心 10 min，

(5) 棄上清。加 6-8 mL 清洗液混勻，60-100 g，離心10 min，棄去上清后以0.2 mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后移入0.5 mL EP管。

(6) 取20 μL CD8+T細(xì)胞分選磁珠，加入細(xì)胞懸液，混勻。4℃孵育20 min，每5 min輕輕彈一次。

(7) 過(guò)MS分選柱: 將MS柱放入Vario MACS分選系統(tǒng)的磁場(chǎng);加500 μL buffer沖洗MS柱;待buffer完全過(guò)柱后，加入細(xì)胞懸液，收集流出液——未標(biāo)記細(xì)胞;待細(xì)胞完全過(guò)柱后，加buffer洗MS柱(3×1 mL)，最后用配套的活塞推出CD8+T細(xì)胞于0.5 mL EP管中。

人外周血CD8+T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)步驟

加入CD8+T細(xì)胞完全培養(yǎng)基，CD3/CD28磁珠，將CD8+T細(xì)胞移入T25培養(yǎng)瓶，密度為5x105/mL。當(dāng)細(xì)胞密度超過(guò)1x106后進(jìn)行等量補(bǔ)液。培養(yǎng)體積擴(kuò)大后依次轉(zhuǎn)入T75和T175進(jìn)行擴(kuò)增。