背景簡介

脾臟是機(jī)體重要的免疫器官之一，含有大量的淋巴細(xì)胞，占全身淋巴組織總量的25%，在小鼠中，由于小鼠血液量少，從外周血液中分離大量淋巴細(xì)胞較為困難，故經(jīng)常需要從其脾臟中獲取大量的淋巴細(xì)胞。采用磁珠陰選獲得高純度CD3+T細(xì)胞，本法獲得的CD3+T可直接可用于后續(xù)分子生物學(xué)或細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

小鼠脾臟分選CD3+T細(xì)胞分離培養(yǎng)視頻教程

主要試劑

紅細(xì)胞裂解液、分選 buffer、磁力架

小鼠脾臟分選CD3+T細(xì)胞分離培養(yǎng)操作步驟

1. 制備單細(xì)胞懸液： 在 70 μm 細(xì)胞篩網(wǎng)上研磨脾臟，以預(yù)冷的 PBS 沖洗細(xì)胞篩網(wǎng)，收集細(xì)胞懸液于50 ml 離心管中， 500 g，離心 5 min。

2. 離心結(jié)束， 棄上清，加入 5 ml 紅細(xì)胞裂解液(ACK) ，室溫裂解 5 min， 再加入 20 ml PBS， 500 g，離心 5 min。

注意： 紅細(xì)胞裂解步驟可根據(jù)所用裂解液不同調(diào)整用量及時間。少量紅細(xì)胞殘留不會影響后續(xù)分選及細(xì)胞純度。

3. 離心完成后， 棄上清，將脾細(xì)胞重懸于 PBS，細(xì)胞懸液用 70 μm 細(xì)胞篩網(wǎng)過濾后，計數(shù)。 計數(shù)完成后， 500 g，離心 5 min。

注意：細(xì)胞懸液需要過細(xì)胞篩網(wǎng)，以除去組織和細(xì)胞團(tuán)塊，否則會影響后續(xù)細(xì)胞分選純度。

4. 離心完成后， 棄上清，將細(xì)胞重懸于分選 buffer 中，調(diào)整細(xì)胞密度為 1×108 cells/ml。

注意：分選 buffer 為含有 2 mM EDTA 和 2% 胎牛血清(FBS)的 PBS 或者含有 2 mM EDTA 和 0.5%BSA 的 PBS， 需預(yù)先通過 0.22 μm 濾膜過濾除菌。

5. 將 100 μl 細(xì)胞懸液(1×107 個細(xì)胞)加入無菌流式管底部， 再加入 2 μl Biotin-Antibody Mix，混勻后4°C 孵育 10 min。

注意：加入細(xì)胞懸液時將細(xì)胞加入流式管底部，避免沿流式管管壁加入。根據(jù)所使用磁力架不同也可使用離心管進(jìn)行細(xì)胞分選。如果分選更多細(xì)胞，則按比例增加 Biotin-Antibody Mix 的用量。

6. 孵育完成后， 在流式管中加入 20 μl Streptavidin beads(使用前渦旋振蕩重懸磁珠，確保磁珠完全重懸)，混勻后 4°C 孵育 10 min。

注意：如果分選更多細(xì)胞， 則按比例增加Beads用量。例如分選 5×107 個細(xì)胞， 在500 μl細(xì)胞懸液中加入10 μl Biotin-Antibody Mix和100 μl Streptavidin Beads。 如果分選少于1×107個細(xì)胞，則將細(xì)胞懸液體積補(bǔ)至 100 μl， 加入 2 μl Biotin-Antibody Mix 和 20 μl Streptavidin Beads。

7. 孵育完成后， 在流式管中加入 2.5 ml 分選 buffer， 用移液器上下混合吹打 5 次混勻(避免劇烈振蕩或者上下顛倒混勻)。

8. 將含有細(xì)胞的分選流式管置于磁力架上，靜置 5 min。

9. 將細(xì)胞懸液輕柔倒入一個無菌離心管中(傾倒過程中流式管不要脫離磁力架)， 此細(xì)胞懸液中即包含純化的小鼠 CD3+ T 細(xì)胞， 500 g，離心 5 min。 離心后棄上清，收集細(xì)胞。

10. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要洗滌細(xì)胞后，將細(xì)胞重懸于所需緩沖液或培養(yǎng)基中，即可用于后續(xù)分子生物學(xué)或細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。