細(xì)胞培養(yǎng)最大的危險(xiǎn)是發(fā)生培養(yǎng)物的細(xì)菌、真菌和病青等微生物的污染，為更好地保證無(wú)菌間內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)處于一個(gè)良性的操作環(huán)境，小逸特地整理了關(guān)于在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中如何消毒滅菌及有效避免污染，供科研小伙伴參考。

要控制污染問(wèn)題的出現(xiàn)就要對(duì)可能引起污染的因素以及實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌與消毒的措施有所認(rèn)識(shí)污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常見(jiàn)的原因有操作間或周周空間的不潔，境養(yǎng)皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不徹底。由于有關(guān)培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)的失誤均能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，故細(xì)胞培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)都應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范，防止發(fā)生污染。

細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)無(wú)菌環(huán)境的要求較為嚴(yán)格。微生物污染通常是造成細(xì)胞培養(yǎng)失敗的主要原因，細(xì)胞間的殺菌主要涉及空氣的殺菌，常見(jiàn)消毒方法分為三類：物理滅菌法(紫外線、濕熱、干烤、過(guò)濾等)，化學(xué)滅菌法(各種化學(xué)消毒劑)和抗生素。

細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)消毒方法

1.物理滅菌法

1.1紫外線消毒

紫外線是一種低能量的電磁輻射，可殺死多種微失物。革蘭阻性菌最為敏感。其次是陽(yáng)性菌。再次為芽孢、真菌孢子的抵抗力最強(qiáng)。紫外線的直接作用是通過(guò)破環(huán)微生物的核酸及蛋白質(zhì)等而使其滅活，間接作用是通過(guò)紫外線照射產(chǎn)生的臭氧殺死微生物。直接照射培養(yǎng)室消毒，用法簡(jiǎn)單，效果好。

紫外燈的消毒效果同紫外燈的輻射強(qiáng)度和照射劑量呈正相關(guān)，輻射強(qiáng)度隨燈距離 增加而降低，照射劑量和照射時(shí)間呈正比。因此紫外燈同被照射物的距離和照射時(shí)間要適合。離地面2米的30W燈可照射9平方米房間，每天照射2-3小時(shí)，期間可間隔30分鐘。燈管離地面2米以外要延長(zhǎng)照射時(shí)間，2.5 米照射效果較差。紫外燈照射工作臺(tái)的距離不應(yīng)超過(guò)1.5米，照射時(shí)間30分鐘為宜。由于上述各種情況的不確定性，導(dǎo)致紫外線殺菌效果不是很理想，一般般需要過(guò)夜殺菌。此外紫外線對(duì)人體有傷害作用，紫外燈不僅對(duì)皮膚、眼睛傷害，且對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞與試劑等也產(chǎn)生不良影響，因此不要在紫外線燈照射下進(jìn)行操作。

1.2高溫濕熱滅菌

壓力蒸汽滅菌是最常用的高溫濕熱滅菌方法。對(duì)生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白質(zhì)變性凝固而使微生物死亡。布類、物、璃器皿、屬器皿、膠和某些培養(yǎng)液都可以用這方法滅菌。

不同壓力蒸汽所達(dá)到的溫度不同，不同消毒物品所需的有效消毒壓力和時(shí)間不同。從壓力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品(不包括液體)，應(yīng)立即放到60-70℃烤箱內(nèi)烘干，再貯存?zhèn)溆?，否則，潮濕的包裝物品表面容易為微生物污染。煮沸消毒也是常用的濕熱消毒方法，它具有條件簡(jiǎn)單、使用方便等特點(diǎn)。

1.3高溫干熱消毒

干熱滅菌主要是將電熱烤箱內(nèi)物品加熱到160℃以上，并保持90-120分鐘，殺死細(xì)菌和芽孢，達(dá)到滅菌目的。主要用于滅菌玻璃器皿(如體積較大的燒杯、培養(yǎng)瓶)、金屬器皿以及不能與蒸汽接觸的物品(如粉劑、油劑)。

干熱滅菌后要關(guān)掉開(kāi)關(guān)并使物品逐漸冷卻后在打開(kāi)，切忌立即打開(kāi)，以免溫度驟變而使箱內(nèi)的玻璃器皿破裂。干烤箱內(nèi)物品間要有空隙，物品不要靠近加熱裝置。

燒灼也是滅菌方法之一，常利用臺(tái)面上的酒精燈的火焰對(duì)金屬器皿及玻璃器皿口緣進(jìn)行燒灼消毒。

1.4過(guò)濾除菌

是將液體或氣體用微孔薄膜過(guò)濾，使大于孔徑的細(xì)菌等微生物顆粒阻留，從而達(dá)到除菌目的。在體外培養(yǎng)時(shí)，過(guò)濾除菌大多用于遇熱容易變性而失效的試劑或培養(yǎng)液。目前，大多實(shí)驗(yàn)室采用微孔濾膜濾器除菌。關(guān)鍵步驟是安裝濾膜及無(wú)菌過(guò)濾過(guò)程。

2.化學(xué)消毒法

最常見(jiàn)的是75%酒精及1%的新潔而滅。

75%酒精消毒的原理是通過(guò)使細(xì)菌或真菌表面的蛋白脫水，變性凝固，最終殺死細(xì)菌，主要用于操作者的皮膚、操作臺(tái)表面及無(wú)菌室內(nèi)的壁面處理。

1%新潔而滅的殺菌原理為：①改變細(xì)胞的滲透性，使細(xì)菌破裂;②使蛋白質(zhì)變性;③抑制細(xì)菌體內(nèi)某些酶，使之失去活性;④因其有良好的表面活性，可高濃度聚集于菌體表面，影響細(xì)胞的新陳代謝。新潔爾滅對(duì)化膿性細(xì)菌、腸道菌及部分病毒有一定的殺滅能力;對(duì)結(jié)核桿菌、真菌的殺滅效果不好;對(duì)細(xì)菌芽胞僅能起抑制作用。

3.抗生素消毒

抗生素主要用于消毒培養(yǎng)液，是培養(yǎng)過(guò)程中預(yù)防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不嚴(yán)重時(shí)的“急救”方法。不同抗生素殺滅微生物不同，應(yīng)根據(jù)需要選擇。

可用于細(xì)胞培養(yǎng)的消毒滅菌方法很多，但每種方法都有一定的適應(yīng)范圍。如常用的過(guò)濾除菌系統(tǒng)、紫外照射、電子殺菌燈、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒實(shí)驗(yàn)室空氣;多用新潔而滅消毒實(shí)驗(yàn)室地面;常用干熱、濕熱消毒劑浸泡、紫外照射等方法消毒培養(yǎng)用器皿;采用高壓蒸汽滅菌或過(guò)濾除菌方法消毒培養(yǎng)液。

細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中環(huán)境污染是如何發(fā)生

1.取放細(xì)胞時(shí)引起的污染

細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，取放細(xì)胞是最基本的操作,培養(yǎng)房開(kāi)關(guān)門(mén)的瞬間，環(huán)境中的微生物或多或少會(huì)進(jìn)入培養(yǎng)箱中，而且內(nèi)外溫差導(dǎo)致內(nèi)門(mén)冷凝水的產(chǎn)生，極易吸附微生物，都是造成培養(yǎng)箱污染的風(fēng)險(xiǎn)因素。

2.滅菌不徹底造成的二次污染

細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，因其它操作問(wèn)題(如培養(yǎng)基潑灑，水盤(pán)污染等)，造成培養(yǎng)房的大規(guī)模污染也時(shí)常會(huì)發(fā)生， 此時(shí)就需要對(duì)培養(yǎng)箱進(jìn)行滅菌消毒，常規(guī)的消毒(如紫外照射)只能達(dá)到表面消毒的效果，特別是對(duì)真菌等頑固性污染，無(wú)法進(jìn)行徹底滅菌，導(dǎo)致后續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞污染頻發(fā)。

如何有效避免污染

1.重視細(xì)胞房管理工作，規(guī)范操作

定期進(jìn)行細(xì)胞房清潔消毒工作,規(guī)范實(shí)驗(yàn)人員操作(如身著白大褂、換鞋等)，創(chuàng)造潔凈培養(yǎng)環(huán)境。

2.避免頻繁查看細(xì)胞

做好實(shí)驗(yàn)規(guī)劃，減少培養(yǎng)箱門(mén)開(kāi)關(guān)的頻率，取放細(xì)胞時(shí)需佩戴潔凈的手套，并用少量的70%醫(yī)用酒精(過(guò)多會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)箱中殘留乙醇蒸汽)擦拭培養(yǎng)瓶/皿表面，從而降低細(xì)胞培養(yǎng)箱污染的風(fēng)險(xiǎn)。

3.定期維護(hù)和滅菌，預(yù)防污染

定期清潔維護(hù)，培養(yǎng)箱內(nèi)用水滅菌后使用并定期更換，選擇培養(yǎng)箱時(shí)，可優(yōu)先考慮有自動(dòng)滅菌功能的培養(yǎng)箱。細(xì)胞房一旦發(fā)生污染，及時(shí)進(jìn)行消毒滅菌工作。