體外培養(yǎng)細胞的生長增殖能力的判定，不僅代表了細胞的基本屬性，也是進行藥物檢測、轉化檢測、培養(yǎng)基篩選等許多方面的重要監(jiān)測指標。判定細胞增殖能力的指標主要是生長曲線、分裂指數(shù)、克隆形成率及細胞活力等測定。

細胞生長狀況有關指標的檢測方法

一、細胞計數(shù)

這是細胞培養(yǎng)中常用的基本技術之一。所用材料為血球計數(shù)板，巴氏吸管和顯微鏡。

細胞計數(shù)的基本步驟

(1)取清潔計數(shù)板和專用蓋玻片，用絲綢布輕輕拭干。

(2)取細胞懸液0.3mL，加入0.9mL結晶紫(或臺盼至)染液，混勻后滴半滴于血球計數(shù)板內，以充滿不外溢為宜。也可直接將細胞懸液在一側滴加到蓋玻片中，不要溢出，也不要過少或出現(xiàn)氣泡.

(3)在顯微鏡下用10×物鏡觀察計數(shù)四角大分格中的細胞數(shù)。代入下式得出細胞密度。細胞數(shù)/ml=(4大格細胞數(shù)之和/4)×104×稀釋倍數(shù)臺盼藍染色法可計算出活細胞數(shù)和死細胞數(shù)以測定細胞存活百分率。一般0.5%～1%的臺盼藍染液可使死細胞染成藍色，活細胞不著色。此外還可用0.02%的藻紅B染液將死細胞或受損細胞染成紅色，或用0.05%的苯胺黑染液將死細胞染成黑色。細胞存活百分率=(4大格活細胞數(shù)/4大格活細胞+死細胞數(shù))×100%細胞計數(shù)除用上述方法外，目前還有新型的自動計數(shù)儀，可供大規(guī)模細胞計數(shù)工作使用。各種型號的計數(shù)操作不盡相同，可根據(jù)使用說明進行操作。在進行細胞計數(shù)操作時，必須把細胞懸液準備好，細胞應分散良好，并充分混勻，若出現(xiàn)較多細胞團或細胞數(shù)少于200個/10mm2或多于500個/10mm2時，需重制細胞懸液，重新計數(shù)。

二、細胞生長曲線和生長倍數(shù)

生長曲線是培養(yǎng)細胞生物學特性的基本參數(shù)之一，是測定細胞絕對生長數(shù)的常用方法，也是判定細胞活力的重要指標。

常用于測定藥物等外來因素對細胞生長的影響!

細胞生長曲線是細胞培養(yǎng)實驗中最基本的指標，是測定細胞絕對增長數(shù)值和生長繁殖基本規(guī)律常用的簡便方法。

常用的方法為

在同一規(guī)格的培養(yǎng)瓶中，接種同等量的同一代細胞，經(jīng)培養(yǎng)后每隔24小時取出幾瓶細胞進行計數(shù)，以培養(yǎng)時間為橫座標，不同時刻的細胞數(shù)的對數(shù)為底座標，標出各點并連成線，即為該細胞的生長曲線，可反應出細胞生長的動態(tài)。測定生長曲線的另一種方法是用96孔/24孔細胞培養(yǎng)板，分7組，每組3孔，培養(yǎng)一周(7天)，期間逐日檢測一組，計數(shù)，最后把7天中的細胞數(shù)值繪成圖，即為細胞生長曲線。也可采用MTT法來進行生長曲線測定，較上述方法簡便。標準的細胞生長曲線近似“S”形，一般在傳代后第一天細胞數(shù)有所減少，經(jīng)過一段時間的潛伏期，再進入對數(shù)生長期，達到平臺期和生長穩(wěn)定，最后衰老。細胞生長倍數(shù)是指測定接種時活細胞的濃度，經(jīng)一個生長周期達到最大活細胞濃度的比率。生長倍數(shù)=培養(yǎng)后最大活細胞濃度/接種時的活細胞濃度。

三、細胞分裂指數(shù)細胞分裂指數(shù)

細胞分裂指數(shù)細胞分裂指數(shù)是表示細胞增殖旺盛程度的指標。它以被測1000個細胞中的分裂細胞數(shù)來計算。其方法為：用秋水仙素將細胞處理1～2小時后，按染色體制片法制片并染色，計算1000個細胞中分裂相的數(shù)目，重復4次取平均值，用百分比表示。

基本步驟

(1)細胞準備用蓋片(支持物)培養(yǎng)法。

(2)每24小時取出一個小玻片，按常規(guī)方法進行固定，吉姆薩或HE染色，封片，制成永久標本。

(3)顯微鏡下選擇細胞密度適中的區(qū)域觀察分裂細胞并計數(shù)。逐個視野進行，對每一時間組的玻片各取細胞多、中、少3個區(qū)域各一區(qū)，共數(shù)1000個細胞，計算出平均分裂相值所占百分比。觀察時要掌握好分裂相標準，主要是確定好劃分間期和前期，末期和間期等的界限，以減少誤差。

細胞分裂指數(shù)=細胞分裂相數(shù)/細胞總數(shù)(1000)×1000

四、細胞接種存活率

細胞接種存活率又稱細胞貼壁率。它是細胞被制成分散的懸液后，以低密度(2～5個細胞/cm2)被接種到底物上，貼壁并能存活生長形成細胞小群(克隆)的細胞百分數(shù)值，用以表示細胞的生存能力和細胞群的活力。

基本步驟

(1)取對生長期細胞，用消化法制成細胞懸液，計數(shù)后按檢測細胞生長曲線的接種細胞的原則，將細胞接種于培養(yǎng)瓶(濃度相對高些)。接種12～15瓶。

(2)每2小時取出一瓶細胞，倒掉培養(yǎng)液，然后加入胰酶消化已貼壁細胞，計數(shù)已貼壁細胞，用下面公式逐個計算每個時間上的貼壁率。每2小時一次，共觀察24小時即12。

接種存活率%(貼壁率)=(貼壁存活細胞數(shù)/接種細胞數(shù))×100%

五、克隆形成率

細胞接種存活率只表示接種細胞后貼壁的細胞數(shù)，但貼壁后的細胞不一定每個都能增殖和形成克隆。而形成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞?？寺⌒纬陕史从臣毎后w依賴性和增殖能力兩個重要性狀。由于細胞生物學性狀不同，細胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養(yǎng)細胞克隆形成率弱，傳代細胞系強;二倍體細胞克隆形成率弱，轉化細胞系強;正常細胞克隆形成率弱，腫瘤細胞強。并且克隆形成率與接種密度有一定關系，做克隆形成率測定時，接種細胞一定要分散成單細胞懸液，直接接種在碟皿中，持續(xù)一周，隨時檢查，到細胞形成克隆時終止培養(yǎng)。

1.平板克隆形成試驗基本步驟

(1)取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，把細胞懸浮在10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中備用。

(2)將細胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，以適當?shù)募毎芏?根據(jù)增殖能力)接種于培養(yǎng)皿中。一般分每皿50、100、200個細胞的梯度密度分別接種含10mL 37℃預溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉動，使細胞分散均勻。置37℃ 5% CO2及飽和濕度的環(huán)境下，靜置培養(yǎng)2～3周。

(3)經(jīng)常觀察，當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加純甲醇或1：3醋酸/甲醇5mL，固定15分鐘。然后去固定液，加適量Giemsa應用染色液染10～30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

(4)將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數(shù)克隆，或在顯微鏡(低倍鏡)計數(shù)大于10個細胞的克隆數(shù)。最后計算克隆形成率。

克隆形成率= 克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%

接種細胞數(shù)平板克隆形成試驗方法簡單，適用于貼壁生長的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞一定要分散得好，不能有細胞團，接種密度不能過大。

2.軟瓊脂培養(yǎng)克隆形成試驗基本步驟

(1)取對數(shù)生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，作活細胞計數(shù)，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調整細胞密度至1×106細胞/L。然后根據(jù)實驗要求作梯度倍數(shù)稀釋。

(2)用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個濃度的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40℃中不會凝固。

(3)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。

(4)按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基在無菌試管中相混以后，再向管中加入0.2mL的細胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37℃ 5%CO2溫箱中培養(yǎng)10～14天。

(5)把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細胞克隆數(shù)。計算形成率。軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測腫瘤細胞和轉化細胞系。試驗中瓊脂與細胞相混時，瓊脂溫度不宜超過40℃。接種細胞的密度每平方厘米不超過35個，一般6cm的平皿接種1000個細胞。正常細胞在懸浮狀態(tài)下不能增殖，不適用于軟瓊脂克隆形成試驗。

六、細胞周期

標記有絲分裂百分率法(percentage labeledmitoses，PLM)

對測定細胞進行脈沖標記、定時取材、利用放射自顯影技術顯示標記細胞，通過統(tǒng)計標記有絲分裂細胞百分數(shù)的辦法來測定細胞周期。放射標記物為3H或者14C標記的TdR。

七、MTT法測定細胞活力

四唑鹽(MTT)商品名為噻唑藍，四唑鹽比色法的原理：活細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍紫色產(chǎn)物甲躦(formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜(DMSO)能溶解沉積在細胞中藍紫色結晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標儀測定OD值。

MTT法簡單快速、準確，廣泛應用于新藥篩選、細胞毒性試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。

操作步驟

(1) 細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板; 103-104細胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200微升(96孔培養(yǎng)板每孔容積370微升)，37°C、5%CO2培

養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間(根據(jù)實驗目的決定培養(yǎng)時間)。

(2)加入2毫克/毫升的MTT液(50微升/孔);繼續(xù)培養(yǎng)3小時。

(3)吸出孔內培養(yǎng)液后，加入DMSO液(150微升/孔)，將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結晶物溶解。

(4)酶標儀檢測各孔OD值(檢測波長570納米)。記錄結果，繪制細胞生長曲線。

每隔24小時測量一個點，3個平行樣品。